翟振麗，申 煒，馬維紅，焦清海

巨噬細(xì)胞的極性是指巨噬細(xì)胞根據(jù)微環(huán)境的變化改變自身表型和生理特性，從而分化為特征差異的不同種群。根據(jù)激活方式和功能的不同巨噬細(xì)胞可分化為經(jīng)典激活性巨噬細(xì)胞(c1assica11y activated macrophages，CAMs或M1)和替代激活性巨噬細(xì)胞(a1ternative1y activated macrophages，AAMs或 M2)。M1型巨噬細(xì)胞主要負(fù)責(zé)抵抗病原微生物，發(fā)揮促炎作用;M2型則具有抗炎和組織修復(fù)的功能［1］。

巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)換的機(jī)制尚未完全闡明，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。為明確TLR4與巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)換的關(guān)系，本研究通過觀察TLR4阻滯劑CLI－095抑制To11樣受體 4(To11－1ike receptors，TLR4)mRNA 表達(dá)后對(duì)巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的影響，探討TLR4在巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)換中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠(4～6周，雌性)，體質(zhì)量16～20 g，SFP級(jí)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(湘)2011－0003。

1.2 主要試劑和儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基高糖DMEM、胎牛血清(Hyc1one公司)，雙抗(氨芐青霉素鈉、硫酸鏈霉素)(上海第四制藥廠)，胰酶(華美生物工程公司)，小鼠重組γ－干擾素(Peprotech公司)，大腸桿菌脂多糖(Sigma 公司)，TLR4 阻滯劑 CLI－095(Invivogen公司)，異硫氰酸熒光素(f1uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠F4/80抗體(BioLegend公司)，CD16/32抗體(BioLegend公司)，CD206抗體(ABD公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的同型抗體(BioLegend公司)，小鼠白細(xì)胞介素(IL)－12、IL－10 ELISA 檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒(北京艾德萊試劑公司)，M－MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，熒光定量 PCR試劑盒 Maxima SYBR Green qPCR master MIX(Thermo公司)，TRL4及內(nèi)參β-actin基因的引物由Invitrogen公司合成;FASC AriaⅢ細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂)，熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI7500)。

1.3 骨髓來源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 參考Prade1等［2］的方法，經(jīng)L929成纖維細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)生成骨髓來源的巨噬細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞膜特異性標(biāo)記F4/80，鑒定巨噬細(xì)胞純度。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按數(shù)字表法隨機(jī)分為3組:(1)對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞48 h，不給予任何藥物處理。(2)模型組，誘導(dǎo)生成的巨噬細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h，換液后加入終濃度為1.0×105U/L的γ干擾素(IFN－γ)和5 μg/L的脂多糖(LPS)培養(yǎng)24 h。(3)處理組，先予1 mg/L的CLI－095培養(yǎng)細(xì)胞24 h，換液后加入終濃度為1.0×105U/L的 IFN－γ和5 μg/L的 LPS培養(yǎng)24 h。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白表達(dá) 用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，5×105個(gè)/管分裝，2 000 r/min(離心半徑11 cm)離心10 min，棄上清，再用100 μ1 PBS重懸細(xì)胞，分裝至1.5 m1 EP管中，分別加入0.5 μg FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠F4/80抗體，1 μg FITC 染色的 CD16/32 抗體，1 μg FITC 染色的CD206抗體及對(duì)應(yīng)的同型抗體，4℃避光孵育30 min，PBS 清洗 2 次，離心，再用 300 μ1 PBS 重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌 收集各組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，檢測(cè)分泌型IL－10、IL－12的表達(dá)水平。按照試劑盒的說明操作，配好標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置陰性對(duì)照，加入標(biāo)記抗體，溫育、洗板、終止、讀板，450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 按試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)基因庫(kù)設(shè)計(jì)PCR引物序列如下:TLR4引物:上游 5’－AGACCTCAGCTTCAATGGTG－3’;下游5’－GAGACTGGTCAAGCCAAGAA－3’。β－actin 引物:上游 5’－TCCGTAAAGACCTCTATGCC－3’;下游 5’－TACTCCTGCTTGCTGATCC－3’。根 據(jù) SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明操作，利用美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μ1:SYBR Green 染料10 μ1，PCR 上游引物(10 μmo1/L)0.8 μ1，PCR 下游引物 (10 μmo1/L)0.8 μ1，ROX 0.005 μ1，待測(cè)樣品 cDNA 1.6 μ1，去離子水 6.75 μ1。反應(yīng)條件:50℃預(yù)處理2 min，95℃預(yù)變性10 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s，40個(gè)循環(huán);做擴(kuò)增曲線及融解曲線;每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)檢測(cè)3次，反應(yīng)以 β－actin為內(nèi)參對(duì)照;采用比較循環(huán)閾值法(ΔΔCt)分析樣本中TLR4 mRNA的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，2組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓來源巨噬細(xì)胞的鑒定 體外將原代骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)分化生成骨髓來源巨噬細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞的膜表面標(biāo)志F4/80，純度為(96.2±0.2)%，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 M1型巨噬細(xì)胞的建立 模型組與對(duì)照組比較，CD16/32［(91.17±1.99)%比(66.2±2.17)%］和IL－12［(747.27±3.74)比(220.87±8.17)ng/L］的表達(dá)率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CD206［(0.33±0.12)%比(0.77±0.12)%］明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);IL－10［(22.91±2.47)%比(23.56±4.30)ng/L］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，符合M1型巨噬細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD16/32高表達(dá)、CD206表達(dá)微弱、分泌因子IL－12高表達(dá)、IL－10呈低表達(dá)的表型特點(diǎn)，提示造模成功。

2.3 CLI－095對(duì)TLR4 mRNA表達(dá)的影響 用熒光定量PCR檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:模型組TLR4 mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(1.000±0.003比0.778±0.002)，處理組TLR4 mRNA的表達(dá)明顯低于模型組(0.804±0.009比1.000±0.003)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示M1型巨噬細(xì)胞TLR4呈高表達(dá)，而CLI－095對(duì)TLR4的表達(dá)具有抑制作用。

2.4 膜蛋白CD16/32和CD206的表達(dá)以及分泌型IL－10和IL－12的檢測(cè) 處理組巨噬細(xì)胞CD206的表達(dá)陽性率［(2.87±0.21)%比(0.33±0.12)%］和分泌型IL－10的表達(dá)［(182.67±6.12)%比(32.91±2.47)ng/L］明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CD16/32表達(dá)陽性率［(54.83±1.60)%比(91.17±1.99)%］及分泌型IL－12的表達(dá)［(184.67±9.71)%比(747.27±3.74)ng/L］明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá) CD206、IL－10，低表達(dá) CD16/32、IL－12 的表型特點(diǎn)。見圖1～3。

圖1 對(duì)照組膜蛋白CD16/32和CD206表達(dá)

3 討論

圖2 模型組膜蛋白CD16/32和CD206表達(dá)

圖3 處理組膜蛋白CD16/32和CD206表達(dá)

巨噬細(xì)胞是一種不均一的多亞群細(xì)胞類型，它的泛在性和分化的組織特異性賦予巨噬細(xì)胞一些特異性的功能，根據(jù)功能不同巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型2種極化表型，分別代表巨噬細(xì)胞功能的兩個(gè)極端。巨噬細(xì)胞極性概念的提出使人們對(duì)巨噬細(xì)胞這一研究對(duì)象有了新的認(rèn)識(shí)，M1型巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的促炎能力，其分子標(biāo)記物通常選用IL－12和CD16/32，M2型巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)志物主要有CD206和IL－10，具有抗炎、組織修復(fù)的作用。巨噬細(xì)胞具有可塑性，M1與M2型巨噬細(xì)胞之間存在相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象［3］。環(huán)磷酸腺苷可抑制巨噬細(xì)胞的促炎因子分泌，升高抗炎因子，形成M1到M2的表型轉(zhuǎn)換［4］。通過人為干預(yù)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型向有利的方向極化是今后研究的方向，Hasegawa－Moriyama等［5］研究顯示，羅格列酮通過增加M2/M1的比例減弱疼痛敏感性。法舒地爾通過誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化抑制炎癥反應(yīng)治療腦脊髓炎［6］。

近些年有關(guān)巨噬細(xì)胞與TLR4相關(guān)性研究顯示，巨噬細(xì)胞在聚集的情況下，TLR4缺乏可減弱脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗［7－8］;M1型巨噬細(xì)胞對(duì)TLR4呈高表達(dá)，而M2型巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)抑制腫瘤因子2可負(fù)調(diào)節(jié)TLR4調(diào)節(jié)通路;高表達(dá)活化轉(zhuǎn)錄因子3具有抑制TLR4轉(zhuǎn)錄、減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞極化的作用［9］;TLR4缺乏可減弱炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脂肪組織中M2型巨噬細(xì)胞生成［9］。綜合以上研究，筆者提出TLR4可能是M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化的重要因素。

筆者的前期研究［10－11］已發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白 A1(apoA1)具有抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的作用，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎性M2型極化，且發(fā)揮抗炎作用可能與抑制 TLR4－MyD88－IRF5信號(hào)通路有關(guān)。為進(jìn)一步探討TLR4在巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中的作用，本研究利用TLR4阻滯劑CLI－095進(jìn)行干預(yù)處理后與M1型巨噬細(xì)胞組比較，結(jié)果顯示干預(yù)后TLR4 mRNA表達(dá)明顯降低，提示TLR4的表達(dá)受到明顯抑制，而處理后巨噬細(xì)胞的CD206和IL－10明顯升高，CD16/32和IL－12明顯下調(diào)，符合M2型巨噬細(xì)胞的特性，提示TLR4在巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中可能具有重要的作用，抑制TLR4表達(dá)有促使巨噬細(xì)胞向M2型極化的可能。

本研究從細(xì)胞水平研究巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化與TLR4的相關(guān)性，初步顯示TLR4在巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化中具有重要作用，抑制TLR4表達(dá)具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎性M2型極化的可能。

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