李向南，李永華，袁紅斌

神經(jīng)病理性疼痛是一種常見(jiàn)的難治性疼痛，指原發(fā)或繼發(fā)于神經(jīng)系統(tǒng)損害、功能障礙所導(dǎo)致的疼痛。創(chuàng)傷、手術(shù)、糖尿病及感染常導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，而臨床上有效的治療辦法并不多。衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(sate11ite g1ia1 ce11s，SGCs)作為背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中圍繞感覺(jué)神經(jīng)元的膠質(zhì)細(xì)胞，其神經(jīng)免疫功能受到疼痛學(xué)研究的普遍重視。目前認(rèn)為，外周神經(jīng)損傷后，激活的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)啟動(dòng)了一系列免疫炎癥反應(yīng)，分泌包括腫瘤壞死因子α(TNF－α)在內(nèi)的一系列促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)元的痛覺(jué)過(guò)敏［1］。晚期糖化終產(chǎn)物受體(recepotr for advanced g1ycation end products，RAGE)，是一種細(xì)胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受體，廣泛分布，其下游NF－κB入核調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放［2］。本研究旨在觀察抑制炎癥因子的上游RAGE中和抗體是否對(duì)腰5脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠神經(jīng)病理性疼痛的緩解有更好的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007－0003。篩選基礎(chǔ)痛閾值在10～18 g之間的大鼠，分為3組:(1)對(duì)照組10只，暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)，但不結(jié)扎，注射生理鹽水。(2)安慰劑組10只，暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)并結(jié)扎，術(shù)后鞘內(nèi)注射生理鹽水。(3)藥物組10只，暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)并結(jié)扎，手術(shù)后鞘內(nèi)注射RAGE中和抗體5 μg/d，至術(shù)后第7天。各實(shí)驗(yàn)組大鼠采用低劑量(約 10 μ1)緩慢注射(3.3 μ1/min)的方法以保證注射藥物擴(kuò)散在大鼠腰5脊神經(jīng)。實(shí)驗(yàn)中SD大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由攝取水和食物，手術(shù)前6 h禁食禁飲。

1.2 方法

1.2.1 鞘內(nèi)置管 于大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉20 mg/kg，消毒后，沿脊椎中線切開(kāi)皮膚，找到 L5、L6棘突根部縫隙，用小針刺破，將PE－10導(dǎo)管內(nèi)充滿生理鹽水后，從縫隙中插入髓鞘內(nèi)約1.5 cm。導(dǎo)管從皮下沿脊柱向上在大鼠頸部穿出固定，封閉導(dǎo)管，消毒分層縫合肌肉及皮膚。以大鼠鞘內(nèi)注射10 μ1利多卡因后后腳明顯出現(xiàn)癱軟，30 min內(nèi)恢復(fù)反應(yīng)作為手術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)。置管成功后單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 將置管成功的大鼠，參考Kim等［7］方法建立大鼠腰 5神經(jīng)根結(jié)扎(SNL)模型。大鼠麻醉后，于大鼠L4～S2棘突水平沿背部皮膚作縱向中線切口，分離肌肉至第5腰椎橫突，切斷橫突暴露第5腰神經(jīng)，用5－0絲線結(jié)扎神經(jīng)，縫合皮膚與肌肉，避免術(shù)后感染。對(duì)照組僅暴露但不結(jié)扎L5神經(jīng)，其余步驟相同。

1.2.3 免疫組化熒光染色 采用數(shù)字表法隨機(jī)選取正常大鼠和SNL后大鼠各4只麻醉后灌流固定，取術(shù)側(cè)L5和L4背根神經(jīng)節(jié)，放入4%PFA固定4～6 h，然后用20%蔗糖/PBS溶液脫水2 d。將組織包埋15 μm切片，貼片在92.5℃的水浴抗原修復(fù)10 min。0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min。貼片滴加羊抗RAGE多克隆一抗(1∶100)，室溫孵育16～18 h，0.01 mo1/L PBS 漂洗3 次，每次5 min，然后加Cy3－驢抗羊 IgG 二抗(1∶400)，0.01 mo1/L PBS漂洗3次，每次5 min，加甘油分封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照(×400)。

1.2.4 測(cè)定機(jī)械縮爪閾值和熱刺激縮爪潛伏期分別于手術(shù)前1 d、手術(shù)后第1、3、5、7天測(cè)定大鼠機(jī)械縮爪閾值(paw withdraw1 thresho1d，PWT)和熱刺激縮爪潛伏期(paw therma1 withdraw 1atency，PT－WL)。測(cè)定前將大鼠置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)15 min后，用von Frey纖毛絲自金屬網(wǎng)下部垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤4 s，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定首先從2 g刺激開(kāi)始，如該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激;如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激。如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。每次刺激間隔30 s。用熱板法測(cè)定各組大鼠熱刺激縮爪潛伏期。將大鼠放入熱板痛覺(jué)測(cè)痛儀上。待大鼠在透明的玻璃箱內(nèi)安靜后，開(kāi)啟電源輻射刺激足底。當(dāng)大鼠出現(xiàn)逃避性抬腿或者舔足時(shí)，立刻切斷熱源，記錄開(kāi)始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射時(shí)間(s)，照射截止時(shí)間為20 s，以防大鼠足底灼傷。每只大鼠重復(fù)3次，取平均值即為PTWL。

1.2.5 ELISA測(cè)定 將大鼠麻醉后，在生理鹽水冰面上迅速分取L5背根神經(jīng)節(jié)，勻漿粉碎組織后加入組織裂解液，0℃靜置30 min，以12 000 r/min低溫離心5 min后，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。采用雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測(cè)TNF－α和白細(xì)胞介素(IL)－1β。將酶標(biāo)包被板分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)孔和空白對(duì)照孔，將標(biāo)準(zhǔn)液和樣本分別加入相應(yīng)孔中37℃孵育1 h，洗滌;加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體37℃孵育40 min，洗滌，加入底物 OPD，顯色，在492 nm處測(cè)光密度值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本的 TNF－α、IL－1β 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型建立 L5 SNL術(shù)后大鼠出現(xiàn)術(shù)側(cè)后足不愿著地、足底外翻等典型機(jī)械痛敏體征，機(jī)械縮爪反射閾值呈逐步下降，說(shuō)明制作的SNL模型是成功的。

2.2 SNL術(shù)后RAGE表達(dá)量變化 圖1 A、B、C分別表示大鼠正常背根神經(jīng)節(jié)、SNL術(shù)后L5背根神經(jīng)節(jié)、SNL術(shù)后L4背根神經(jīng)節(jié)?？梢?jiàn)SNL術(shù)后RAGE平均熒光強(qiáng)度為(42.80±4.19)，比術(shù)前(19.78±4.19)表達(dá)水平增高(P＜0.05)，而L4背根神經(jīng)節(jié)并無(wú)明顯變化。結(jié)果提示，SNL術(shù)后RAGE在神經(jīng)病理性痛疼的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 RAGE在SNL前后表達(dá)變化免疫組化圖

2.3 行為學(xué)研究結(jié)果 SNL術(shù)后，L5背根神經(jīng)節(jié)RAGE平均熒光強(qiáng)度(42.80±4.19)比術(shù)前(19.78±4.19)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠術(shù)后1、3、5、7 d機(jī)械縮爪閾值(9.30±2.10，4.60±1.35，3.80 ±1.4，3.60 ±1.26)與對(duì)照組(13.00±2.58，12.50±2.64，13.50 ±2.42，13.00±2.58)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。安慰劑組大鼠術(shù)后1、3、5、7 d熱刺激縮爪潛伏期(10.01±1.16，5.40+1.50，4.32 ±1.16，4.40 ±1.43)與對(duì)照組(12.80±1.14，13.00±1.25，12.70 ±1.34，12.80±1.55)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術(shù)后3、5、7 d機(jī)械縮爪閾值(8.00±2.31，7.40±2.12，7.20 ±1.93)與安慰劑組(4.60±1.35，3.80±1.40，3.60 ±1.26)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術(shù)后3、5、7 d熱刺激縮爪潛伏期(8.15±1.37，8.26±1.29，7.00±1.07)與安慰劑組(5.40±1.51，4.32±1.16，4.40±1.43)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠TNF－α和IL－1β的表達(dá)變化 為了確定RAGE中和抗體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制，筆者通過(guò)ELISA檢測(cè)了其下游促炎細(xì)胞因子TNF－α和IL－1β的表達(dá)情況。藥物組大鼠術(shù)后L5背根神經(jīng)節(jié)TNF－α表達(dá)量(70.53±6.57)與安慰劑組(109.90±4.97)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組大鼠術(shù)后L5背根神經(jīng)節(jié)IL－1β表達(dá)量(88.24±3.60)與安慰劑組(168.77±6.34)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械縮爪閾值與熱刺激縮爪潛伏期

3 討論

RAGE作為細(xì)胞膜表面免疫球蛋白超家族蛋白受體，具有多種配體，包括HMGB1 S100/鈣結(jié)合蛋白、淀粉樣多肽［3］。在生理狀態(tài)下呈低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞處于激活或應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，受損細(xì)胞中RAGE的表達(dá)增多。RAGE與配體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，其中最重要的是氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加和免疫炎性反應(yīng)的加劇，最終產(chǎn)生致病效應(yīng)。RAGE與不同配體結(jié)合后，可以激活細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，比如 Ras－ERK、p38－MAPK 和 cdc42/rac途徑，其多種信號(hào)通路大部分可通過(guò)NF－κB調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。NF－κB的激活可引起靶細(xì)胞產(chǎn)生大量的促炎因子，加劇炎癥反應(yīng)［4］。而外周神經(jīng)組織損傷后，作為外周傳入中樞信號(hào)換元的重要結(jié)構(gòu)，背根神經(jīng)節(jié)的功能異常對(duì)痛覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏具有關(guān)鍵作用。衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞圍繞感覺(jué)神經(jīng)元，由縫隙連接相連，包繞感覺(jué)神經(jīng)元構(gòu)成了一個(gè)感覺(jué)神經(jīng)元的微環(huán)境，一方面調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能，另一方面其穩(wěn)定性也受神經(jīng)元的影響。筆者的研究發(fā)現(xiàn)RAGE在L5脊神經(jīng)結(jié)扎后的DRG組織中表達(dá)增加，印證了Shibasaki等研究結(jié)果，根據(jù)其研究報(bào)道，RAGE在SNL模型建立后脊髓背角的表達(dá)沒(méi)有顯著差異［5］。

圖3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況

外周神經(jīng)損傷后，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的功能和狀態(tài)發(fā)生改變。激活的衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞增殖并啟動(dòng)了一系列免疫炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)DRG感覺(jué)神經(jīng)元的痛覺(jué)過(guò)敏，在這個(gè)過(guò)程中釋放大量的促炎癥因子。以往的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α是神經(jīng)系統(tǒng)較早釋放的促炎細(xì)胞因子之一，其受體TNFR在毗鄰損傷的外周神經(jīng)元上表達(dá)上調(diào)［3］，提示TNF－α可能在神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。炎癥因子一方面作用于神經(jīng)元，通過(guò)膠質(zhì)神經(jīng)元交互作用改變神經(jīng)元的敏感性，另一方面又可自分泌作用于SGCs，形成正反饋，使pERK水平長(zhǎng)時(shí)間增高，進(jìn)一步增加其下游NF－κB表達(dá)入核促炎因子的釋放，加劇疼痛狀態(tài)的維持等［6］。雖然干預(yù)TNF－α的信號(hào)通路可以改善外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致的痛覺(jué)過(guò)敏，但臨床上通過(guò)干預(yù)炎癥因子的方法治療疼痛存在治療時(shí)間窗短，療效差等問(wèn)題［7］。筆者的研究將炎癥因子的上游調(diào)節(jié)蛋白R(shí)AGE作為靶點(diǎn)，采用鞘內(nèi)給予RAGE中和抗體而阻斷RAGE信號(hào)傳導(dǎo)能夠扭轉(zhuǎn)周?chē)窠?jīng)損傷后導(dǎo)致的痛覺(jué)過(guò)敏，可能是通過(guò)抑制衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少了TNF－α和IL－1β生成。

綜上所述，外周神經(jīng)損傷可引起RAGE在背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)增高，而鞘內(nèi)注射RAGE中和抗體，可以減少TNF－α和IL－1β的表達(dá)并且改善SNL后大鼠痛閾值。鑒于RAGE對(duì)神經(jīng)病理性疼痛發(fā)揮的作用，干預(yù)其信號(hào)通路傳導(dǎo)對(duì)治療神經(jīng)病理性疼痛的具有良好的前景。

［1］ Jasmin L，Vit JP，Bhargava A，et a1.Can sate11ite g1ia1 ce11s be therapeutic targets for pain contro1［J］.Neuron G1ia Bio1，2010，6(1):63－71.

［2］ Xie J，Méndez JD，Méndez－Va1enzue1a V，et a1.Ce11u1 Signa1of the receptor for advanced g1ycation end products(RAGE)［J］.Ce11u1ar Signa11ing，2013，25(11):2185－2197.

［3］ Sch?fers M，Sorkin LS，Geis C，et a1.Spina1 nerve 1igation induces transient upregu1ation of tumor necrosisfactor receptors 1 and 2 in injured and adjacent uninjured dorsa1 rootgang1ia in the rat［J］.Neurosci Lett，2003，347(3):179－182.

［4］ Hess A，Axmann R，Rech J，et a1.B1ockade of TNF－α rapid1y inhibits pain responses in the centra1 nervous system［J］.PNAS，2011 ，108(9):3731－3736.

［5］ Shibasaki M，Sasaki M，Miura M，et a1.Induction of high mobi1ity group box－1 in dorsa1 root gang1ion contributesto pain hypersensitivity after periphera1 nerve injury［J］.Pain，2010 ，149(3):514－521.

［6］ Doya H，Ohtori S，Takahashi K，et a1.Extrace11u1ar signa1－regu－1ated kinase mitogen－activated protein kinase activation in the dorsa1 root gang1ion(DRG)and spina1 cord after DRG injury in rats［J］.Spine，2005，30(20):2252－2256.

［7］ Kim SH，Chung JM.An experimenta1 mode1 for periphera1 neuropathy produced by segmenta1 spina1 nerve 1igation in the rat［J］.Pain，1992 ，50(3):355－363.