張連娣 梁學(xué)林

消支飲治療小鼠生殖道解脲支原體感染對(duì)血清干擾素-γ的影響

張連娣 梁學(xué)林

建立小鼠生殖道解脲支原體(Uu)感染的動(dòng)物模型, 觀察中藥復(fù)方“消支飲”治療小鼠生殖道Uu感染對(duì)小鼠血清中干擾素-γ(IFN-γ)的影響, 探討“消支飲”的療效機(jī)制。

生殖道解脲支原體感染；消支飲；小鼠；干擾素-γ

解脲支原體(Uu)是介于細(xì)菌與病毒之間的最小原核微生物, 屬于柔膜體綱、支原體科、脲原體屬的微生物。主要寄生在人類泌尿生殖道黏膜表面, 女性生殖道感染后可上行至子宮腔和輸卵管腔引起相應(yīng)部位的炎癥。針對(duì)其病因病機(jī)導(dǎo)師梁學(xué)林教授制定了以健脾益氣, 升陽(yáng)除濕為主, 佐以清熱解毒殺蟲(chóng)的治療大法, 自擬“消支飲”方治療本病, 注重扶正祛邪, 固護(hù)正氣, 尤其對(duì)抗生素治療耐藥的患者更為適宜。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以中藥“消支飲”方, 治療Uu感染, 并設(shè)西藥“阿奇霉素”為對(duì)照組, 從小鼠Uu轉(zhuǎn)陰率、血清干擾素-γ兩方面觀察“消支飲”的治療作用。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C小鼠104只購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所, 鼠齡8周, 雌性, 清潔級(jí), 體重(20±2)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備 消支飲：由太子參、山藥、柴胡、炙甘草、陳皮、白芍、炒荊芥、車前子、蒼術(shù)、炒白術(shù)、黃柏、苦參等中草藥組成, 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局制備,濃縮至2 g/ml(即1 ml煎液內(nèi)含有2 g生藥), 滅菌備用。

阿奇霉素：石家莊歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn), 規(guī)格：0.25 g/片,生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10980218。

1.3 主要試劑 Uu標(biāo)準(zhǔn)株：Uu血清8型凍干標(biāo)準(zhǔn)株, 由南華大學(xué)微生物教研室提供。復(fù)蘇并傳代后備用。

液體培養(yǎng)基：購(gòu)于珠海麗珠試劑有限公司, 批號(hào)：YZB/粵0205-2007。

固體培養(yǎng)基：購(gòu)于上海恩康生物科技有限公司, 批號(hào)：YZB/滬0948-40-2005。

小鼠IFN-γ定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒：購(gòu)于ADLITTERAM DIAGNOSTIC LABORATORIES, 批號(hào)：QRCT-301330101003-EIA/UTL。

1.4 主要儀器及設(shè)備 酶聯(lián)免疫吸收分析儀, 型號(hào)Anthos-2010, 用于測(cè)定血清IFN-γ；日本奧林巴斯BX51號(hào)顯微鏡,用于小鼠陰道分泌物Uu檢測(cè)觀察。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Uu菌液制備 將凍于-80℃的Uu血清8型標(biāo)準(zhǔn)株置37～45℃水浴中1 min, 使其快速融化, 無(wú)菌接種于Uu液體培養(yǎng)基, 37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h, 見(jiàn)液體培養(yǎng)基由黃變紅, 且液體澄清透亮無(wú)渾濁、沉淀, 可確認(rèn)有Uu生長(zhǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Uu菌液制成2.5×105ccu/ml濃度, 經(jīng)1000 r/min 4℃離心集菌備用。

2.2 動(dòng)物造模 在同樣條件下, 隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F、G 7組。模擬Taylor-Robinson的造模方法, A、B、C、D、E、F組每只小鼠頸部皮下注射苯甲酸雌二醇0.4 mg, 濃度1 mg/ml, 每周1次, 共4次。A、B、C、D、E、F組小鼠在經(jīng)過(guò)雌激素預(yù)處理后, 將血清8型濃度為2.5×105cuu/ml的Uu菌液用留滯針軟管取20 μl注入小鼠陰道, 連續(xù)給菌3 d。小鼠在接種Uu 1周后取小鼠陰道分泌物進(jìn)行檢測(cè)。用2支無(wú)菌棉簽棒伸入小鼠陰道0.5 cm輕輕轉(zhuǎn)動(dòng), 將第1支棉簽在液體培養(yǎng)基(1 ml)中充分洗脫, 進(jìn)行液體培養(yǎng)；第2支棉簽接種于Uu固體培養(yǎng)基平板上。固體和液體培養(yǎng)基均放于37℃孵育箱孵育, 24～48 h后觀察結(jié)果, 液體培養(yǎng)基顏色由黃變紅且澄清, 固體培養(yǎng)基長(zhǎng)出典型“煎蛋樣”Uu菌落, 提示造模成功。

2.3 分組給藥治療 消支飲預(yù)防高劑量組(A組：14只小鼠,造模同時(shí), 給予中藥“消支飲”80 g/(kg·d), 連續(xù)給藥4周；消支飲預(yù)防低劑量組(B組)：14只小鼠, 造模同時(shí), 給予中藥“消支飲”20 g/(kg·d), 連續(xù)給藥4周；消支飲治療高劑量組(C組)：17只小鼠, 造模成功后, 給予中藥“消支飲”80 g/(kg·d), 連續(xù)給藥3周；消支飲治療低劑量組(D組)：17只小鼠, 造模成功后, 給予中藥“消支飲”20 g/(kg·d), 連續(xù)給藥3周；阿奇霉素組(E組)：14只小鼠, 造模成功后,給予西藥“阿奇霉素”0.2 g/(kg·d), 連續(xù)給藥2周；模型組(F組)：16只小鼠, 造模成功后, 給予0.9%的生理鹽水, 連續(xù)3周；空白組(G組)：12只小鼠, 正常飼養(yǎng), 與模型組同時(shí)給予0.9%的生理鹽水, 連續(xù)3周；灌胃量：每10 g小鼠給0.4 ml的藥液, 每天給藥1次。

2.4 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo) 小鼠轉(zhuǎn)陰率的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)給藥結(jié)束后,全部小鼠取陰道分泌物進(jìn)行檢測(cè)。24～48 h后觀察結(jié)果。于奧林巴斯BX51號(hào)顯微鏡下觀察并拍照。

小鼠血清中IFN-γ值檢測(cè)：用消毒眼科鑷取出小鼠眼球, 取小鼠眼球血, 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸收分析儀檢測(cè)血清IFN-γ值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示, 行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

小鼠在接種Uu 1周后取小鼠陰道分泌物進(jìn)行檢測(cè)。液體及固體培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果顯示：A、B、C、D、E、F組小鼠均感染了Uu, 感染率100%, 空白組12只小鼠均未感染Uu,感染率0。證明實(shí)驗(yàn)造模成功。

3.1 治療后Uu轉(zhuǎn)陰率 各組小鼠治療4周后對(duì)小鼠分泌物Uu檢測(cè)結(jié)果, 見(jiàn)表1。

表1 各組治療后Uu轉(zhuǎn)陰率的比較(n, %)

3.2 血清IFN-γ檢測(cè) 取小鼠眼球血, 離心分離出血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法, 由酶聯(lián)免疫吸收分析儀讀取結(jié)果, 換算出最后IFN-γ值?；静襟E①取出酶標(biāo)板, 依照次序?qū)?yīng)分別加入100 μl的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；②分別標(biāo)記樣品編號(hào), 加入100 μl 樣品于空白微孔中；③在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50 μl的酶標(biāo)記溶液；④(36±2)℃孵育反應(yīng)60 min；⑤洗板機(jī)清洗5次, 每次靜置10～20 s；⑥每孔加入底物A、B液(呈色劑)各50 μl；⑦(36±2)℃下避光孵育反應(yīng)15 min；⑧每孔加入50 μl終止液, 終止反應(yīng)。

結(jié)果判斷：于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；B=標(biāo)準(zhǔn)品OD值、B0=標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)OD值；以B/B0%值為縱坐標(biāo), 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo), 在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍；敏感度為1.0 pg/ml, 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)小鼠IFN-γ含量。應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)各組小鼠血清中IFN-γ值,見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中IFN-γ值

表2 各組小鼠血清中IFN-γ值

注：與模型組比較,aP＜0.05；與阿奇霉素組比較,bP＜0.05

組別例數(shù)IFN-γ值(pg/ml)消支飲預(yù)防高劑量組529.5410±17.1234消支飲預(yù)防低劑量組622.5202±10.8519ab消支飲治療高劑量組1433.4491±6.9497消支飲治療低劑量組1338.0744±18.7311阿奇霉素組1436.1215±14.3131模型組1140.5749±22.6526空白組1229.4369±12.5943

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果分析

4.1.1 治療后轉(zhuǎn)陰率分析 各組小鼠治療4周后對(duì)小鼠分泌物Uu檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明, 消支飲和阿奇霉素對(duì)Uu感染均有治療作用。本實(shí)驗(yàn)屬于急性Uu感染, 根據(jù)轉(zhuǎn)陰率可以說(shuō)明, 阿奇霉素對(duì)急性Uu感染的抑菌作用優(yōu)于消支飲, 且消支飲高劑量組療效優(yōu)于低劑量組。

4.1.2 干擾素-γ值分析 國(guó)內(nèi)外專家研究發(fā)現(xiàn)Uu發(fā)病與免疫因素有關(guān), 其中IFN-γ由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生, 是遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DHSR)中最重要的細(xì)胞因子, 多位學(xué)者認(rèn)為, 在Uu感染致病過(guò)程中與輸卵管損傷有關(guān)。Shcheglovitova等［1］發(fā)現(xiàn)Uu感染婦女血清IFN-γ水平升高。袁淑珍［2］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)輸卵管支原體感染不孕婦女輸卵管液中IFN-γ水平升高,認(rèn)為支原體感染引起的輸卵管炎癥導(dǎo)致不孕可能與IFN-γ升高有關(guān)。IFN-γ作為免疫細(xì)胞因子, 在正常情況下, 對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用；如其過(guò)度表達(dá), 則引起免疫損傷。韓延華等［3］用80只小鼠做Uu感染后血清IFN-γ的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究, 通過(guò)自擬方劑消抗靈Ⅱ號(hào)和阿奇霉素治療, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)消抗靈Ⅱ號(hào)和阿奇霉素均能降低Uu感染引起的血清IFN-γ的水平升高, 說(shuō)明通過(guò)治療與防治, 可能影響Uu感染引起的血清IFN-γ的高水平。

本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法, 檢測(cè)各組小鼠血清中IFN-γ值, 應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：小鼠感染Uu后, IFN-γ值有上升趨勢(shì)。用藥治療后：①各組與模型組比較, 其中消支飲預(yù)防低劑量組與模型組比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 說(shuō)明消支飲能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平。②各組與阿奇霉素組比較, 其中消支飲預(yù)防低劑量組與阿奇霉素組比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 說(shuō)明消支飲較阿奇霉素更能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究, 可以看出消支飲是治療Uu感染的有效方劑。該方不僅能有效改善Uu感染引起的生殖道組織炎癥, 且能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平, 能整體調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能, 與現(xiàn)代研究認(rèn)為Uu致病與免疫因素有關(guān)是相一致的。而且這為中醫(yī)藥治療Uu感染開(kāi)辟了新途徑,提供了理論依據(jù)。

［1］ Shcheglovitova ON, Maksianina EN, Rastegaeva IN, et al.Status of interferon in genital infections.Vopr Virusol, 2001, 46(2):36.

［2］ 袁淑珍.輸卵管支原體感染不孕婦女輸卵管液中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平.醫(yī)學(xué)臨床研究, 2006, 23(5):707-708.

［3］ 韓延華, 辛雪艷.消抗靈Ⅱ號(hào)對(duì)小鼠解脲支原體感染及感染后血清中干擾素-γ的影響.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 3(2): 83-85.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.210

2015-02-09］

123000 阜新市第二人民醫(yī)院(婦產(chǎn)醫(yī)院)中醫(yī)婦科(張連娣)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科(梁學(xué)林)