逯 昀，韓 霜

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000; 2.商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

虎掌南星組織培養(yǎng)的初步研究

逯 昀1，韓 霜2

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000; 2.商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

以虎掌南星(Rhizoma Pinelliae PedatisECTae),的塊莖為試驗(yàn)材料，用不同消毒處理對(duì)虎掌南星外植體進(jìn)行滅菌，并進(jìn)行愈傷組織及叢生芽產(chǎn)生的初步研究. 結(jié)果表明：虎掌南星外植體洗刷干凈后使用75%乙醇溶液滅菌30s，后再用0.1%HgCl2消毒15min，每次消毒后用無(wú)菌水清洗5遍，每遍3min. 這種處理方法污染率較低. 無(wú)論從平均愈傷組織誘導(dǎo)率還是從愈傷組織的質(zhì)量上看，虎掌南星愈傷組織在MS上誘導(dǎo)優(yōu)于B5.

虎掌南星；滅菌方法；培養(yǎng)基

虎掌南星為天南星科植物虎掌PinelliapedatisECTaSchott的塊莖. 別名：掌葉半夏、天南星、麻芋果. 古代本草有關(guān)虎掌性味功能的記載如《神農(nóng)本草經(jīng)》：“虎掌味苦溫；主心痛，寒熱結(jié)氣，積聚伏梁，傷筋痿拘緩，利水道”；《吳普本草》：“神農(nóng)雷公無(wú)毒，岐伯桐君辛有毒”；《名醫(yī)別錄》：“虎掌微寒，有大毒”. 不過(guò)，它的扁球形塊莖卻是一味中藥，有祛痰、消腫毒的功效. 主治中風(fēng)、半身不遂、癲癇、驚風(fēng)、破傷風(fēng)、跌打損傷或蟲(chóng)蟻咬傷等病癥[1]66-72，[2]45，[3]49-51. 虎掌南星自然繁殖率很低，由于其極高的藥用價(jià)值，近幾年野生資源受到了無(wú)節(jié)制地采挖，已近枯竭.目前虎掌南星的組織培養(yǎng)快繁研究仍未取得很圓滿(mǎn)的結(jié)果[2]45. 本文通過(guò)虎掌南星組織培養(yǎng)研究以期達(dá)到虎掌南星資源可持續(xù)利用的目的.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試虎掌南星來(lái)自安徽碭山、河南南陽(yáng). 外植體為塊莖、莖段、葉片以及果實(shí).

1.2 材料消毒

虎掌南星外植體用洗衣粉洗凈后，再用洗衣粉水浸泡30 min，流水沖30 min，無(wú)菌水沖洗2遍，75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3～4遍待用.

1.3 培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)選用MS為基本培養(yǎng)基，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用BA4.0 mg/l+2,4-D 0.5 mg/L的混合性，全光照24 h培養(yǎng)，溫度為20 ℃.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同消毒方法滅菌效果的影響

將已消毒好的塊莖在超凈工作臺(tái)上先用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3～4遍，每遍3 min；再用0.1% HgCl2消毒. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)2種處理，每次消毒后用無(wú)菌水清洗5遍，每遍3 min，后用濾紙吸干表面水分并將塊莖切口端剪去一部分后接入培養(yǎng)基中. 每瓶培養(yǎng)基中接種3個(gè)外植體，每種處理共接種45個(gè)外植體，每種處理重復(fù)兩組[4]6-7，[5]62-64，[6]259-261. 具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 0.1%氯化汞不同消毒時(shí)間設(shè)計(jì)方案

不定期地對(duì)外植體的污染和無(wú)菌外植體的存活動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀察記錄，接種45 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率和無(wú)菌外植體的存活率.

污染率%=(污染外植體數(shù)/總外植體數(shù))×100%

存活率%=(成活外植體數(shù)/總外植體數(shù))×100%

1.4.2 不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取虎掌南星塊莖、莖段、葉片以及果實(shí)4部分，接種于MS+6-BA 4 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中. 確定植株4個(gè)不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，每個(gè)處理接種15個(gè)外植體，重復(fù)3次.

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

1.4.3.1 愈傷組織誘導(dǎo)

誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)中，每隔3 d觀測(cè)一次，觀察期為45 d. 統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織發(fā)生時(shí)間[7]59-61.

愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%

愈傷組織發(fā)生時(shí)間=達(dá)到最終愈傷誘導(dǎo)率1/2的天數(shù)

1.4.3.2 不定芽誘導(dǎo)

芽誘導(dǎo)期間，每隔5 d進(jìn)行一次觀察，觀察期為60 d. 統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出芽的愈傷組織數(shù)(以高度大于0.2 cm的不定芽為有效芽)，計(jì)算每個(gè)處理的芽誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)時(shí)間.

芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù))×100%

芽誘導(dǎo)時(shí)間=達(dá)到最終芽誘導(dǎo)率1/2時(shí)的天數(shù)

平均每塊愈傷組織出芽數(shù)=誘導(dǎo)出的芽數(shù)/產(chǎn)生芽的愈傷組織數(shù)

1.4.3.3 生根培養(yǎng)

生根培養(yǎng)過(guò)程中，以根長(zhǎng)達(dá)到0.5 cm的根為有效根，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理平均生根率、每株苗平均根數(shù)及根生長(zhǎng)狀況，并記錄每個(gè)處理根誘導(dǎo)時(shí)間. 觀察期為30 d.

生根率=(生根株數(shù)/誘導(dǎo)株數(shù))×100%

每株苗平均根數(shù)=總根數(shù)/誘導(dǎo)株數(shù)

2 結(jié)果和分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

不同消毒的時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響，經(jīng)方差分析和多重比較，從消毒時(shí)間來(lái)看，綜合污染率和成活率情況，虎掌南星較適合的消毒方式是經(jīng)75%酒精浸泡30 s后，用0.1%氯化汞處理15 min左右，然后無(wú)菌水沖洗5～8遍. 污染率為0，死亡率低，出愈率為100%，與另外的處理相比有極顯著差異. 具體分析結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 0.1%氯化汞不同消毒時(shí)間對(duì)虎掌南星污染率的影響

注：小寫(xiě)字母表示0.05差異顯著水平，下同.

2.2 不同器官愈傷組織的誘導(dǎo)情況

根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的特點(diǎn)，本試驗(yàn)采用虎掌南星的葉片、莖段、果實(shí)和塊莖4個(gè)部位作為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)情況的對(duì)比，其結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 虎掌南星不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3可以看出，虎掌南星的塊莖是最適合誘導(dǎo)愈傷組織的外植體，其他3個(gè)部分都沒(méi)有愈傷組織產(chǎn)生. 塊莖作為外植體的平均愈傷誘導(dǎo)率及愈傷組織發(fā)生時(shí)間與葉片、莖和果實(shí)作為外植體的平均愈傷誘導(dǎo)率及愈傷組織發(fā)生時(shí)間有極其顯著的差異.

2.3 芽的誘導(dǎo)情況

芽的誘導(dǎo)情況見(jiàn)表4.

表4 芽誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生根培養(yǎng)情況

經(jīng)觀察虎掌南星愈傷組織在分化培養(yǎng)基上，大約10 d，便可以在誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基中有不定根的發(fā)生，說(shuō)明該植物生根較容易. 但將這樣的苗切割下來(lái)進(jìn)行練苗移栽不易成活，所以有必要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行根的誘導(dǎo). 在不同的生根培養(yǎng)基中的生根結(jié)果如表5所示.

表5 基本培養(yǎng)基及NAA濃度對(duì)生根的影響

在以上8個(gè)處理中，試驗(yàn)號(hào)為10的處理外，其余7個(gè)處理的生根率都達(dá)到了100%，但是明顯在試驗(yàn)號(hào)1～2上即基本培養(yǎng)基為MS的根比較細(xì)長(zhǎng)，而試驗(yàn)號(hào)為3～6，即基本培養(yǎng)為1/2MS上生長(zhǎng)的根比較粗且長(zhǎng). 從生根所需天數(shù)來(lái)看，隨著NNA濃度的升高，誘導(dǎo)所需的時(shí)間也逐漸縮短，但是，NAA濃度為1.0時(shí)，生長(zhǎng)出來(lái)的根不利于后期移栽的成活，所以，綜合生根數(shù)、生根所需天數(shù)以及生根的長(zhǎng)度考慮，最適合的配方是1/2MS+NAA0.1 mg/L，即試驗(yàn)號(hào)為15的配方.

3 討論

綜合前面的數(shù)據(jù)分析，本研究獲得了如下主要結(jié)論：

虎掌南星的最佳外植體是塊莖， 0.1%升汞最適宜消毒時(shí)間為15 min，消毒后的塊莖接種于MS+BA4.0 mg/L+2,4-D0.5 mg/L培養(yǎng)基上，每天14h光照培養(yǎng)能達(dá)到100%的出愈率.

芽的誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基是MS+BA 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L，誘導(dǎo)率可達(dá)100%，誘導(dǎo)時(shí)間為19 d，在誘導(dǎo)10 d后，每塊愈傷組織上平均出現(xiàn)芽19個(gè).

根的誘導(dǎo)以1/2MS+NAA 0.1 mg/L為最佳組合，誘導(dǎo)根發(fā)生需要的時(shí)間為19 d，平均生根數(shù)為6條.

幼苗生根后，置于室溫自然光下練苗7d，然后連同整塊愈傷組織轉(zhuǎn)移到腐殖土:細(xì)沙(1∶1)的滅菌基質(zhì)中，成活率可達(dá)到83.3%.

[1] 汪 蕾, 張繼振. 天南星屬植物研究進(jìn)展[J]. 延邊大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004,30(1).

[2] 盛玉婷. 植物組織技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008,14(9).

[3] 杜樹(shù)山, 孟 蕾, 徐艷春,等. 天南星屬植物研究進(jìn)展(綜述)[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2001,24(3).

[4] 薛 淮, 劉 敏, 張純花. 中國(guó)藥用植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].植物雜志,2002(1).

[5] 陳文武, 彭蘭華. 藥用植物的組織培養(yǎng)的應(yīng)用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(5).

[6] 郭余龍, 賈永芳, 楊星勇,等. 半夏的組織培養(yǎng)及其成分比較[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2003,11(3).

[7] 羅光明, 楊雅琴, 何 雁.半夏的快速繁殖與胚狀體誘導(dǎo)[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003,15(2).

[責(zé)任編輯 冰 竹]

The Preliminary Research on the Tiger Palm South Star Tissue Culture

LU Yun1，HAN Shuang2

(1.ShangqiuVocationalandTechnicalCollege,Shangqiu476100,China；2.KeyLaboratoryofPlant-MicrobeInteractions,DepartmentofLifeScience,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu476000,China)

Taking the tuber of tiger palm nanxing (Rhizoma Pinelliae PedatisECTae,) as test materials, with different disinfection treatment on tiger palm south star explant for sterilization, the preliminary study of the multiple shoot clumps is carried out. The experiment is that after washing clean sterilization 30s, using 75% ethanol solution and then disinfected with 0.1% HgCl2, the tiger palm south star explant is cleaned for 15 minutes, every time washing 5 times with sterile water after disinfection, every time 3 minutes. The results of this method of handling show that the pollution rate is low. From the power of the average callus induction rate of callus quality point of view, tiger palm south star callus induced on MS is better than that of B5.

Rhizoma Pinelliae PedatisECTae；the sterilization method；medium

2015-03-13

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：142300410321)；商丘市科技局項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：20121043)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：142102310484)

逯 昀(1975- )，女，河南民權(quán)人，商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院副教授，碩士，主要從事園藝植物的組織培養(yǎng)研究。

1671-8127(2015)02-0083-04

S567.239

A