付 鑫，王愛妍，丁峰山，何時義，楊東君，凌 敏

結(jié)核分枝桿菌耐受活性氧和活性氮基因的研究進展

付 鑫，王愛妍，丁峰山，何時義，楊東君，凌 敏

活性氧和活性氮是生物體新陳代謝過程的中間產(chǎn)物，性質(zhì)活潑，具有強氧化性。激活的巨噬細胞內(nèi)存在大量的活性氧和活性氮，能夠破壞病原菌的生物膜，改變蛋白質(zhì)的功能，損害DNA的遺傳信息，最終抑制或殺死入侵的病原微生物。結(jié)核分枝桿菌侵入機體，主要在巨噬細胞內(nèi)存活并大量繁殖。在氧化和氮化脅迫下，結(jié)核分枝桿菌基因在轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生明顯改變，幫助結(jié)核分枝桿菌逃逸巨噬細胞的殺傷作用。本文綜述了結(jié)核分枝桿菌耐受活性氧和活性氮基因的研究進展，并總結(jié)了各基因之間的調(diào)控通路。

活性氧；活性氮；巨噬細胞；結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核病是僅次于艾滋病的單一致死性傳染病[1]。近幾年來，隨著人口流動性增大，以及青少年免疫力的普遍下降，使結(jié)核病發(fā)病率不斷升高。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2012年全球結(jié)核病患者有860萬例，其中耐多藥結(jié)核病患者占5.23%，結(jié)核病與艾滋病雙重感染者占到12.79%，死亡130萬例，全球還約有300萬例的結(jié)核病患者沒有被發(fā)現(xiàn)[2]，而我國又是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一。可見，結(jié)核病耐藥菌株的蔓延，與HIV雙重感染的流行以及發(fā)病率的低檢出率，都是對我國乃至全球結(jié)核病防治工作的一大挑戰(zhàn)。

結(jié)核病的主要致病菌—結(jié)核分枝桿菌(MTB)，是典型的胞內(nèi)寄生菌，可侵犯周身各器官而發(fā)病，以肺結(jié)核為主。巨噬細胞是MTB的主要宿主細胞，也是宿主抵抗清除MTB所依賴的主要機制之一。激活的巨噬細胞吞噬作用加強，引發(fā)呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮中間體，從而將入侵的病原菌殺死。然而，被吞入的MTB也會采取相應(yīng)的措施抵抗或修復(fù)活性氧和活性氮造成的損傷。下面就以MTB耐受活性氧、活性氮基因的研究進展做一簡要綜述。

1 活性氧和活性氮

ROS和RNS的特點是性質(zhì)活潑，易奪取其他分子的電子，具有強氧化性。正常機體中，ROS和RNS在的產(chǎn)生和清除使其維持在對機體無害的水平，參與機體的防御和一些生理活性物質(zhì)的生成。ROS和RNS的產(chǎn)生有多種途徑，其中NADPH氧化酶和一氧化氮合酶(iNOS)尤為重要。當機體受到微生物入侵時，巨噬細胞通過呼吸爆發(fā)(respiratory burst)產(chǎn)生大量的ROS和RNS，進而破壞入侵病原菌的細胞膜、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，最終消滅病原微生物。

2 結(jié)核分枝桿菌抵抗ROS或(和)RNS的機制

ROS和RNS易氧化脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸，使生物膜變脆，通透性改變。蛋白質(zhì)分布廣比例大，也是活性自由基偏愛的靶分子，活性自由基能夠使敏感氨基酸殘基(His、Pro、Trp、Cys和Tyr等)發(fā)生突變，蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，巰基氧化，構(gòu)象改變，功能改變。DNA雙螺旋外側(cè)的嘌呤和嘧啶易被氧化修飾，造成基因突變或單(雙)鏈斷裂，改變遺傳信息。

2.1 MTB的生物學(xué)特性 MTB細胞壁厚，由大量的脂質(zhì)構(gòu)成，占到了菌體的20%～40%，胞壁脂質(zhì)含量越多，疏水性越強，對環(huán)境的抵擋作用則越強。其脂質(zhì)包含索狀因子、磷脂、脂肪酸和蠟質(zhì)等，組成索狀因子的分枝菌酸與抗酸性有關(guān)，MTB肽聚糖外層包圍了大量分枝菌酸，使其能夠在巨噬細胞低pH值環(huán)境中存活。MTB基因組DNA富含鳥嘌呤G和胞嘧啶C，含量高達65.5%，并且約有250個基因編碼特殊的脂類，形成的獨特胞壁能使MTB適應(yīng)巨噬細胞的惡劣環(huán)境，逃逸免疫細胞的殺傷作用。

分枝桿菌中功能保守的MmpL11蛋白能夠轉(zhuǎn)運包含脂質(zhì)的分枝菌酸(mycolic acid-containing lipids)到細胞壁，參與細胞壁(膜)的合成[3]。在致病性分枝桿菌細胞壁中存在的聚-L-谷氨酸(Poly-L-glutamate/glutamine)能夠抵擋中低水平的氮化脅迫，在高水平氮化脅迫中谷氨酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)的表達和活性則會明顯降低[4]。研究證實，氧化脅迫會使鳥分枝桿菌(MAC)膜生成增強，自誘導(dǎo)分子-2(autoinducer-2，AI-2)也參與其中[5]。

2.2 耐受基因及其作用 ROS和RNS的殺菌機制主要是通過破壞病原菌胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，而菌體通過調(diào)控具有氧化還原功能的蛋白的基因表達，消除ROS或RNS，或修復(fù)其造成的損傷，從而達到在宿主體內(nèi)存活的目的。

2.2.1 katG基因 在革蘭氏陰性菌中，OxyR是氧化應(yīng)激的一個重要蛋白，它不僅是ROS的感受器還是轉(zhuǎn)錄激活子，能夠引發(fā)過氧化氫酶和烷基過氧化物酶的表達。盡管MAC的OxyR基因序列保持了完整性，而在多種分枝桿菌的研究中只有恥垢分枝桿菌應(yīng)對ROS時類似于OxyR，相同實驗條件下MTB則局限在KatG[6]。

結(jié)核分枝桿菌katG基因編碼熱穩(wěn)定性的過氧化氫-過氧化物酶(catalase-peroxidase)，2 223 bp，是一種雙功能酶，在抵抗巨噬細胞的氧化激增中發(fā)揮重要的作用。其基因的突變、缺失也常導(dǎo)致耐受異煙肼(INH)菌株的出現(xiàn)[7]。MTB-KatG不僅能分解代謝NADPH氧化酶產(chǎn)生的過氧化物[8]，也具有過氧亞硝基還原酶(peroxynitrite reductase)活性[9]，能夠分解部分RNS，抵抗巨噬細胞對MTB的殺傷作用。

KatG與經(jīng)典的過氧化氫酶沒有結(jié)構(gòu)相似性，并且作用于H2O2的機制也不相同。KatG通過兩個相互作用的輔因子亞鐵血紅素(heme)和Met-Tyr-Trp (MYW)共價加合物來催化高水平或一般水平的H2O2[10]，而一般的過氧化氫酶并不需要其他的電子傳遞體。酶促動力學(xué)模擬實驗顯示，在KatG的亞鐵血紅素接受通道中，進入活性位點的通道被上方的天冬氨酸殘基(D141)阻礙，而其他部位的藥物結(jié)合位點的結(jié)合能力較弱，結(jié)合D141A突變實驗，進一步驗證了INH在亞鐵血紅素通道中的位置[11]。

2.2.2 硫氧還蛋白系統(tǒng) 真核生物及多數(shù)細菌中谷胱甘肽是主要的抗氧化巰基化合物，放線菌及結(jié)核分枝桿菌中缺少谷胱甘肽系統(tǒng)，更加突出了硫氧還蛋白系統(tǒng)在MTB宿主存活中的作用。目前研究已知，結(jié)核分枝桿菌中有三個基因(trxA、trxB、trxC)編碼硫氧還蛋白，一個基因(trxR)編碼硫氧還蛋白還原酶，一個基因(tpx)表達硫氧還蛋白過氧化物酶。其中NADPH、Trx、TrxR組成了經(jīng)典的硫氧還蛋白體系。

Trx是在多種生物中被普遍研究的一種蛋白，它們擁有保守的催化結(jié)構(gòu)域WCXXC，以及約12 kDa的低分子量。MTB-Trx與人類Trx同一性為35%[12]。Tpx不能從TrxA獲得電子，TrxB和TrxC才是具有功能的二硫化物還原酶[13]，TrxA貌似是一種隱性表達的蛋白，其存在的意義還未知。硫氧還蛋白除能夠直接還原過氧化物，作為過氧化物酶的氫供體外，還是MTB-蛋白激酶G(Protein kinase G，PknG)N端的結(jié)構(gòu)域。在PknG中雖然Trx自身并沒有活性，但缺失卻會嚴重影響PknG的活性[14]。

TrxR是一種含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域NADPH依賴型的二聚體酶, 屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶。MTB-TrxR與E.coli-TrxR有45%的同一性和63%的同源性，與人類TrxR有28%的同一性[12]。TrxR通過還原Trx上的-S2為-SH，維持Trx的還原態(tài)，而NADPH結(jié)構(gòu)域和FAD結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥rx的還原循環(huán)則是必需的[15]。

2.2.3 ahpC基因 烷基氫過氧化物還原酶的還原活性是由兩個AhpF和兩個AhpC組成的四聚體發(fā)揮的。AhpC通過N端保守的半胱氨酸殘基的氧化來代謝過氧化物和過氧化亞硝基。為了完成催化循環(huán)，半胱氨酸殘基必需得被還原,在鼠傷寒沙門氏菌中，AhpF為AhpC提供電子，而MTB缺少AhpF，代替其功能的是AhpD，具有硫辛酰胺應(yīng)答活性位點。AhpC通過AhpD與二氫硫辛酰胺脫氫酶(Lpd)和二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(SucB)連接，組成一個過氧化物酶體系[16]。AhpC還能通過TrxC從硫氧還蛋白體系獲得電子，但不能通過TrxB[17]。

2.2.4 msrA基因 甲硫氨酸(Met)是重要的甲基供體，Met的氧化會改變一些特殊和重要蛋白質(zhì)的生物活性，如核糖體蛋白等。msrA編碼的甲硫氨酸亞砜還原酶則可以將氧化型甲硫氨酸(Met-O)還原為甲硫氨酸(Met)，修復(fù)胞內(nèi)過氧亞硝基造成的損傷[18]。MTB表達MsrA和MsrB，其中MsrA起到主要的作用，而MsrB在抵抗體內(nèi)和體外ROS時作用是有限的[19]。X-ray晶體結(jié)構(gòu)顯示， 與已知的如牛、大腸桿菌等的MsrA含有三個半胱氨酸殘基(CysA、CysB、CysC)不同，MTB-MsrA只有兩個功能性的半胱氨酸(Cys-13、Cys-154，相當于 CysA、CysB)。CysC的缺失突變實驗顯示，MsrA通過硫氧還蛋白體系還原自身活性位點的能力大大受損甚至喪失，這就提示在MTB中，硫氧還蛋白能夠直接還原CysA-CysB的二硫鍵，從而使MsrA功能再生[20]。在恥垢分枝桿菌中，MsrA不僅能夠提高菌體在胞內(nèi)和胞外的存活能力，還能增強對氫過氧化物的敏耐受能力[21]。

2.2.5 lsr2基因 LSR2是一種H-NS(大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中)樣蛋白，在麻風分枝桿菌中首次發(fā)現(xiàn)，能與DNA序列AT富集區(qū)(尤其是啟動子區(qū))結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達，包括通過水平轉(zhuǎn)移獲得的基因，毒力相關(guān)因子，以及一些抗原蛋白等[22]。當菌體處于惡劣環(huán)境時，LSR2的表達量增加，易于分枝桿菌休眠體的形成，表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。LSR2不僅能夠抑制分枝桿菌藥物操縱子的表達，對普遍的抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥性，還有利于菌體抵抗應(yīng)激反應(yīng)。

有研究表明，LSR2雖不能夠賦予菌體抵抗RNS的能力，但能耐受ROS。其機制不是通過與鐵離子的結(jié)合和清除自由基，而是通過與DNA的結(jié)合，保護DNA，使其能夠抵擋ROS的損傷[23]。恥垢分枝桿菌中，ms4334基因編碼的黃素蛋白能夠加強LSR2對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的抑制作用和對ROS的抵抗能力，lsr2基因的敲除突變株雖然對菌株不是致死性的，但會使菌體形態(tài)發(fā)生改變，對H2O2的敏感性明顯增強，M.aviumsubsp.paratuberculosis中l(wèi)sr2的突變實驗也展現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象[24-25]。相比之下，MTB的lsr2敲除株與野生菌株對ROS的耐受能力并沒有表現(xiàn)出明顯差異[26]。

2.2.6 nrdH基因 nrdH基因編碼NrdH-redoxin，一種小分子量的二硫鍵還原酶，活性類似于硫氧還蛋白，具有CXXC活性位點，但氨基酸序列卻與谷氧還蛋白和mycoredoxins高度相似，可作為核苷酸還原酶的氫供體。吳雷婷等人通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-nrdH (MTB)，過表達NrdH-redoxin的研究表明，NrdH-redoxin能夠提高重組菌的生長能力及對H2O2的耐受能力[27]。NrdH-redoxin在谷氨酸棒狀桿菌中的過表達使得菌體表現(xiàn)出對多種ROS的抵抗能力增強，但卻依賴于硫氧還蛋白過氧化物酶的存在，進而證明NrdH-redoxin在抗ROS的過程中扮演了過氧化物酶輔助因子的角色[28]。不管是在MTB還是谷氨酸棒狀桿菌中，NrdH-redoxin特異性的從TrxR獲得電子，而不是從分枝硫醇[29]。

2.2.7 noxR1和noxR3基因 Ehrt和Jia Ruan等人用構(gòu)建基因組文庫液體篩選的方法得到了同時耐受ROS和RNS的兩個基因noxR1和noxR3[30-31]。在兩個研究中使用的NO供體分別是亞硝酸鈉(NaNO2)和亞硝基谷胱甘肽(GSNO)，得到兩個不同的基因，表明GSNO和NaNO2對病原菌的影響不是等同的。在巨噬細胞中，谷胱甘肽易與NO結(jié)合，生成GSNO，GSNO攜帶等價的NO穿過細胞壁，釋放NO。作為超氧化物，GSNO在殺菌之前得先被菌體吸收，可能更優(yōu)先影響內(nèi)部靶點，而NaNO2可能既影響細胞壁，也影響內(nèi)部靶點。在卡介苗中noxR1的敲除表現(xiàn)出對RNS耐受能力的減弱。但在MTB H37Rv的敲除實驗中[32]，并沒有表現(xiàn)出耐受能力以及毒力的明顯減弱，生長和存活能力也沒有受到顯著影響。這可能是noxR1缺失可從其他信號通路得到補償，但具體機制并未明確。

近年來有研究表明HIV陽性患者合并分枝桿菌感染中非結(jié)核分枝桿菌(NTM)所占比例不斷增大，其中鳥分枝桿菌(MAC)感染最為明顯，且多數(shù)的MAC菌株已經(jīng)顯示出了多耐藥性，這無疑對非結(jié)核分枝桿菌病的防治提出了新的挑戰(zhàn)。本課題組目前已從HIV/AIDS患者痰液中分離得到一株MAC，成功構(gòu)建和保存了該MAC的基因組文庫，為后續(xù)篩選MAC耐受活性氧和活性氮基因，尋找MAC新的藥物靶點做好了實驗準備。

圖1 結(jié)核分枝桿菌抗ROS、RNS反應(yīng)體系示意圖

Fig.1MycobacteriumtuberculosisROS and RNS reaction system schematic diagram

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Ling Min, Email:lingmin70@163.com

Research progress ofMycobacteriumtuberculosisgenes resisting to reactive oxygen and nitrogen species

FU Xin,WANG Ai-yan,DING Feng-shan,HE Shi-yi,YANG Dong-jun,LING Min

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Reactive oxygen (nitrogen) species are intermediates of body’s metabolism, active and strong oxidizing property. The microenvironment of activated macrophages have a mass of reactive oxygen and nitrogen species to inhibit or kill the alien pathogens by destroying biofilms, changing the function of proteins and inducing gene mutation.Mycobacteriumtuberculosiscan not only survive in macrophage, but also increase to large numbers. Oxidative or nitrosative stress will result in massive transcriptional changes which can helpMycobacteriumtuberculosisescape from the damage of reactive oxygen and nitrogen species. In this paper, we reviewed the recent research progress ofMycobacteriumtuberculosisgenes resisting to oxidative or nitrosative stress, and summarize the relationship of them.

reactive oxygen species; reactive nitrogen species; macrophage;Mycobacteriumtuberculosis

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.015

國家自然科學(xué)基金(鳥分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)生存機制的研究 No.81260245)資助

凌敏，Email：lingmin70@163.com

廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧 530021

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81260245)

R378.91

A

1002-2694(2015)09-0854-05

2014-12-01；

2015-05-06