韋小瑜，游 旅，田克誠，唐光鵬，鄒志霆，王定明

·調(diào)查防治·

貴陽地區(qū)2013年腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌的病原監(jiān)測分析

韋小瑜，游 旅，田克誠，唐光鵬，鄒志霆，王定明

目的 對貴陽地區(qū)2013年腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌進(jìn)行病原檢測，為病例的確診和貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌病疫情的預(yù)防和控制提供依據(jù)。方法 收集2013年貴陽地區(qū)感染性腹瀉病例糞便標(biāo)本，接種麥康凱平板，初步生化符合大腸桿菌的菌落，采用多重PCR方法，進(jìn)行致瀉性大腸桿菌種屬鑒定(uid基因)和毒力基因(bfpB、escV、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR、pic)檢測并確定其致病型別。結(jié)果 257份腹瀉病例糞便標(biāo)本共檢出致瀉性大腸桿菌31株，檢出率12.1%，其中EPEC11株，1株為典型EPEC，其余10株為非典型EPEC，EAEC15株，ETEC4株，EIEC1株，未檢出EHEC。3歲及以下的嬰幼兒和18歲及以上的成人是致瀉性大腸桿菌感染的主要人群。結(jié)論 貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌致病型別以EAEC、EPEC為主，嬰幼兒和成人是致瀉性大腸桿菌感染的主要人群，多重PCR檢測方法是診斷致瀉性大腸桿菌病的有效檢測手段。

感染性腹瀉；致瀉性大腸桿菌；多重PCR；毒力基因

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)是腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些具有營養(yǎng)作用的代謝產(chǎn)物，一般不致病，但某些帶有致病基因的大腸桿菌，則引起以胃腸炎為主的一系列的疾病并引起流行，如腹瀉、急性炎癥、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征、敗血癥、新生兒腦炎等[1]。河南[2]、北京[3]曾對腹瀉病例中多種病原監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)致瀉性大腸桿菌檢出率分別居第1位和第4位，該數(shù)據(jù)表明致瀉性大腸桿菌是中國的一大問題。貴陽地區(qū)自1988年報道過嬰幼兒致瀉性大腸桿菌感染病例后[4]，直至目前，貴陽地區(qū)未見腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌的病例報告。本研究收集2013年貴陽地區(qū)感染性腹瀉病例的糞便標(biāo)本，采用多重PCR方法，對初步生化符合大腸桿菌的可疑菌落，進(jìn)行致瀉性大腸桿菌種屬鑒定(uid基因)和毒力基因(bfpB、escV、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR、pic)檢測并確定其致病型別，同時了解貴陽地區(qū)的菌型分布和毒力基因攜帶情況，為病例的確診和疫情的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集貴州省貴陽地區(qū)2013年1月—2013年12月貴陽市婦幼保健院、貴陽市第一人民醫(yī)院、貴陽市第五人民醫(yī)院257例感染性腹瀉病例的糞便標(biāo)本。感染性腹瀉病例定義為每日排便3次或以上、且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、粘膿便或膿血便等)的門診病例。將采集的新鮮標(biāo)本置于卡布運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)，24 h內(nèi)送往實驗室進(jìn)行檢測。

1.2 主要試劑和儀器 卡布運(yùn)送培養(yǎng)基購自北京陸橋，麥康凱瓊脂購自廣東環(huán)凱，大腸桿菌IMViC生化試劑盒購自廣東環(huán)凱，5種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測試劑盒購自北京卓誠惠生,100 bp DNA Marker購自大連寶生物。恒溫培養(yǎng)箱(德國，Binder)；PCR儀(德國80W-Tprofessional Gradient 96)，凝膠成像儀Gel Doc2000型(美國，Bio-Rad)。

1.3 致瀉性大腸桿菌的分離培養(yǎng)和鑒定 將新鮮標(biāo)本直接接種于麥康凱平板，分區(qū)劃線后，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上5個可疑菌落，進(jìn)行IMViC初步生化鑒定，符合大腸桿菌生化特征的菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的提取 初步生化符合大腸桿菌的菌落經(jīng)純培養(yǎng)后用天根細(xì)菌染色體提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取的核酸保存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 5種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測 按照5種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行體系配制。PCR反應(yīng)采用25 μL體系，包括2×PCR Buffer 12.5 μL，10×Multiplex Assay 2.5 μL，25×PCR Enzyme1 μL，雙蒸水7 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃4 min；變性95 ℃30 s，62 ℃退火30 s，延伸72 ℃90 s，循環(huán)30次；72 ℃ 延伸5 min。

1.6 質(zhì)量控制 每批試劑盒均以5種致瀉性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行質(zhì)量控制，分別對5種致瀉性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，每次試驗均以試劑盒內(nèi)陽性對照品作為陽性對照和分子量Marker，以雙蒸水作為陰性對照。

1.7 5種致瀉性大腸桿菌多重PCR結(jié)果分析與判定

1.7.1 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析 使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠，膠的長度為15 cm；電壓值為80 V；用試劑盒內(nèi)陽性對照的PCR產(chǎn)物作為特異性分子Marker。

1.7.2 多重PCR結(jié)果判定 所有大腸桿菌(包括致瀉和非致瀉性大腸桿菌)均有一條uidA的擴(kuò)增條帶(1 480 bp)。在uidA條帶的基礎(chǔ)上，若有毒力基因條帶的擴(kuò)增，則為致瀉性大腸桿菌。根據(jù)擴(kuò)增條帶大小，進(jìn)而確定毒力基因種類，結(jié)合毒力組合方式判定最終致病型別。見表1。EAEC的毒力基因中，單獨astA基因陽性作為EAEC的判定標(biāo)準(zhǔn)目前存在爭議[5-7]，故本研究的EAEC判定標(biāo)準(zhǔn)中僅astA基因陽性的標(biāo)本未判定為EAEC。

表1 致瀉性大腸桿菌毒力基因及陽性判定結(jié)果組合

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)果 標(biāo)本培養(yǎng)18～24 h后，觀察菌落形態(tài)，菌落為桃紅色、圓形、濕潤、有光澤，直徑為2～3 mm，邊緣完整，為大腸桿菌的菌落形態(tài)特征。初步生化IMViC結(jié)果為++--或--++，判斷為大腸桿菌后，保存進(jìn)一步作多重PCR鑒定。

2.2 多重PCR檢測結(jié)果

2.2.1 多重PCR質(zhì)量控制結(jié)果 每批試劑盒以5種致瀉性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株核酸進(jìn)行質(zhì)量控制，均能對5種致瀉性大腸桿菌攜帶的毒力基因進(jìn)行很好的條帶分離。

2.2.2 病原檢測概況 2013年1-12月共收集感染性腹瀉病例標(biāo)本257份，經(jīng)檢測共檢出致瀉性大腸桿菌31株，檢出率12.1%，其中檢出EPEC 11株，檢出率4.3%，檢出ETEC 4株，檢出率1.6%，檢出EIEC 1株,檢出率0.4%，檢出EAEC 15株，檢出率5.8%，未檢出 EHEC。

2.2.3 各種致瀉性大腸桿菌毒力基因譜 31株致瀉性大腸桿菌中，10株僅escV陽性，判定為非典型EPEC，1株escV與bfpB基因陽性，判定為典型EPEC；2株elt陽性，1株estIb陽性，1株elt與estIb基因均陽性，判定為ETEC；8株pic和aggR基因陽性，3株pic陽性，2株pic和astA基因陽性，1株aggR陽性，1株pic、aggR和astA基因陽性，判定為EAEC；1株invE陽性，判定為EIEC。見圖1。

M: Marker and positive; 1-4: ETEC; 5-15: EPEC; N: negative control; 16-30: EAEC; 31: EIEC.

2.2.4 腹瀉病例致瀉性大腸桿菌的分布 從表1看，男性150例，共檢出致瀉性大腸桿菌20株，檢出率為13.3%，女性107例，檢出致瀉性大腸桿菌11株，檢出率為10.3%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，男女的檢出率無統(tǒng)計學(xué)意義。257例腹瀉病例中，3歲及以下嬰幼兒有207例，占總腹瀉病例數(shù)80.5%，4～17歲學(xué)生組腹瀉病例僅9例，無致瀉性大腸桿菌感染病例，18歲以上的成人組檢出率為14%。貴陽地區(qū)腹瀉病例主要集中在5-10月，共檢出致瀉性大腸桿菌27株。

表2 貴陽地區(qū)腹瀉病例致瀉性大腸桿菌分布

3 討 論

致瀉性大腸桿菌根據(jù)其毒力機(jī)制，將其分為腸致病性(EnteropathogenicE.coli,EPEC)、腸出血性(EnterohemorrhagicE.coli, EHEC)、腸產(chǎn)毒性(EnterotoxigenicE.coli, ETEC)、腸侵襲性(EnteroinvasiveE.coli, EIEC)、腸粘附性(EnteroadherentE.coli, EAEC)大腸桿菌5種類型[8]。如何從腹瀉患者的糞便中快速而準(zhǔn)確地分離鑒定5種致瀉性大腸桿菌，是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、暴發(fā)疫情處置及臨床研究的基礎(chǔ)。

國內(nèi)大部份實驗室在腸致瀉性大腸桿菌診斷方面還是以傳統(tǒng)的細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)、 生化、血清鑒定為“金標(biāo)準(zhǔn)”，其鑒定方法存在實驗過程繁瑣、耗時長、診斷血清因子不全、大腸桿菌的O群不和特定的毒力因子相對應(yīng)以及根據(jù)血清學(xué)結(jié)果無法判斷其致病性等不足。如巴西[9]對805株EPEC血清型凝集的菌株進(jìn)行特定毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，有125株未檢出毒力因子。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，利用5種致瀉性大腸桿菌特異基因進(jìn)行檢測和鑒別的PCR方法得到廣泛應(yīng)用[10-11]，對致瀉性大腸桿菌進(jìn)行菌型劃分，得到較好的實驗結(jié)果。

貴陽地區(qū)自1988年報道過嬰幼兒致瀉性大腸桿菌感染病例后[4]，直至目前，貴陽地區(qū)未見腹瀉病例中5種致瀉性大腸桿菌的病例報告。近年由于國內(nèi)外致瀉性大腸桿菌引起的暴發(fā)疫情屢見報道，故對致瀉性大腸桿菌的病原診斷和病例監(jiān)測尤為重要。為了對病例進(jìn)行病原學(xué)診斷，了解目前貴陽地區(qū)5種致瀉性大腸桿菌的型別分布及毒力基因攜帶情況，我們采用傳統(tǒng)生化鑒定和多重PCR方法鑒定相結(jié)合的方法，對貴陽地區(qū)2013年采集的257例腹瀉病例進(jìn)行5種致瀉性大腸桿菌的檢測，結(jié)果2013年貴陽地區(qū)腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌的檢出率為12%，高于我國福建[11]、寧夏[12]報道的檢出率，與長治[13]地區(qū)的檢出率相同。此外，本次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌菌型以EAEC和EPEC為主，與己報道的河南[2]菌型分布一致，與1986年貴陽地區(qū)腹瀉病例以ETEC和EIEC為主的菌型分布不同。本研究中EPEC以僅escV陽性的非典型EPEC為主，與北京[3]、長治[13]等地區(qū)的研究結(jié)果一致，說明非典型EPEC己成為目前國內(nèi)EPEC主要的流行菌型。其次貴陽地區(qū)EAEC以同時攜帶pic和aggR兩種毒力基因為主，本研究EAEC的判定中，未將單獨astA毒力基因陽性的菌株明確判定為EAEC，因該毒力基因與EAEC引起的腹瀉相關(guān)性仍不確切[5-7]。本次監(jiān)測中雖未檢測出EHEC感染病例，但EHEC易引起嚴(yán)重的溶血性尿毒綜合癥，故仍需加強(qiáng)該病原監(jiān)測。

本次監(jiān)測發(fā)現(xiàn)貴陽地區(qū)3歲及以下嬰幼兒腹瀉病例占80.5%，嬰幼兒及成人是貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌病的易感人群，應(yīng)重點加強(qiáng)嬰幼兒監(jiān)護(hù)人員及成人的健康教育宣傳。貴陽地區(qū)腹瀉病例主要集中在7-10月，共檢出致瀉性大腸桿菌25株(占80.6%)，提示貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌病防控的關(guān)鍵時期在夏秋季。

本研究為257例感染性腹瀉病例中致瀉性大腸桿菌病例的確診提供病原學(xué)依據(jù)的同時，揭示了貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌的毒力基因攜帶情況、致病型別在病例中的分布情況，其結(jié)果將為貴陽地區(qū)致瀉性大腸桿菌病疫情的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。另外，由于致瀉性大腸桿菌可以通過食物、水源等方式傳播從而暴發(fā)疫情，故在進(jìn)行腹瀉病例病原監(jiān)測的同時，也可采用多重PCR方法，快速檢測食品中致瀉性大腸桿菌毒力基因以確定病原，對搜索傳染源、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、保證食品安全及疾病防控都具有重要意義。

(致謝：非常感謝貴陽市婦幼保健院趙倩主任、貴陽市第一人民醫(yī)院王燕主任、貴陽市第五人民醫(yī)院李麗主任對本項目的支持！)

[1]Daniel M, Lilo G, Gerhard H, et al. Identification of unconventional intestinal pathogenicEscherichiacoliisolates expressing intermediate virulence factor profiles by using a novel single-step multiplex PCR[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(10): 3380-3390.

[2]Zhu M, Cui S, Lin L, et al. Analysis of the aetiology of diarrhea in outpatients in 2007, Henan province, China[J]. Epidemiol Infect, 2013, 141(3): 540-548.

[3]Qu M, Deng Y, Zhang X, et al. Etiology of acute diarrhea due to enteropathogenic bacteria in Beijing, China[J]. J Infect, 2012, 65(3): 214-222.

[4]Huang XC, Wang DM, Lin YG. Etiologic investigation and report of 206 cases infantile diarrhea[J]. J Clin Pediatrics, 1988, 6(4): 238-239. (in Chinese) 黃學(xué)才, 王定明, 林永根.206例嬰幼兒腹瀉病原學(xué)調(diào)查報告[J].臨床兒科雜志, 1988, 6(4):238-239

[5]Liu XT, Chen Q, Sun H. Adherence characteristics to HEp-2 cells and genes associated with aggregative adherence in EAEC strains isolated from China[J]. J Pathog Biol, 2012, 7(12): 893-896. (in Chinese) 劉學(xué)通, 陳強(qiáng), 孫暉.我國分離株對HEp-2細(xì)胞的粘附特征及集聚性粘附相關(guān)基因分析[J].中國病原生物學(xué)雜志, 2012, 7(12):893-896.

[6]Konno T, Yatsuyanagi J, Saito S. Virulence gene profiling of enteroaggregativeEscherichiacoliheat-stable enterotoxin 1-harboringE.coli(EAST1EC)derived from sporadic diarrheal patients[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 64(3): 314-320

[7]Zajacova ZS, Konstantinova L, Alexa P. Detection of virulence factors ofEscherichiacolifocused on prevalence of EAST1 toxin in stool of diarrheic and non-diarrheric piglets and presence of adhesion involving virulence factors in astA positive strains[J]. Vet Microbiol, 2012, 154(3/4): 365-375.

[8]Kaur P, Chakraborti A, Asea A. EnteroaggregativeEscherichiacoli: An emerging enteric food borne pathogen[J]. 2010, 254. DOI: 10.1155/2010/254159

[9]Campos LC, Franzolin MR, Trabulsi LR, et al. DiarrheagenicEscherichiacolicategories among the traditional enteropathogenicE.coliO serogroups-a review[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2004, 99(6): 545-552.

[10]Chen AP, Chen JH, Yang JS, et al. Application of molecular biology techniques in diagnosis of diarrheagenicEscherichiacoli[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(9): 808-811. (in Chinese) 陳愛平, 陳建輝, 楊勁松,等.分子生物學(xué)技術(shù)在腸致瀉性大腸桿菌診斷中的應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報, 2011, 27(9):808-811.

[11]Yang JS, Li YY, Liao H. Analysis on the surveillance of diarrheagenicEscherichiacoli, Fujian Province, 2010-2012[J]. Prev Med Tribune, 2014, 20(3): 161-162. (in Chinese) 楊勁松, 李玉燕, 廖慧.2010-2012年福建省致瀉性大腸桿菌監(jiān)測結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇, 2014, 20(3):161-162.

[12]Guo BC, Yan LQ, Hao Q, et al. The epidemiological characteristics and current status of the drug resistance of diarrheagenicEscherichiacoliin Ningxia[J]. Ningxia Med J, 2013, 35(4): 307-309. (in Chinese) 郭邦成, 閆立群, 郝瓊,等.寧夏致瀉性大腸桿菌的流行特征及耐藥現(xiàn)狀研究[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 35(4):307-309.

[13]Pang H, Zhao AL, Bai XN, et al. Detection and analysis of diarrheagenicEscherichiacolifrom stool specimens of patients with infectious diarrhea in Changzhi area[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(5): 520-522. (in Chinese) 龐慧, 趙愛蘭, 白向?qū)?長治地區(qū)腹瀉患者致瀉性大腸桿菌的檢測與分析[J].中國人獸共患病學(xué)報, 2013, 29(5):520-522.

Etiological surveillance of DiarrheagenicEscherichiacolifrom infectious diarrheal patients in Guiyang, China, 2013

WEI Xiao-yu,YOU Lü,TIAN Ke-cheng,TANG Guang-peng,ZOU Zhi-ting,WANG Ding-ming

(ResearchInstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

Patients with infectious diarrhea of 2013 were etiologically detected in this study to provide scientific basis for the confirmation and prevention of the cases of diarrheagenicEscherichiacoliin Guiyang, China. A total of 257 samples of stool specimens of diarrheal patients were collected. Each stool specimen was cultured by streaking on MacConkey agar for isolating diarrheagenicEscherichiacoli. Isolates were conducted with biochemical identification and virulence genes detection by multiplex PCR. The 31 diarrheagenicEscherichiacolistrains were isolated from the total 257 specimens, accounting for 12.1%. Among the 31 diarrheagenicEscherichiacolistrains, there were 11 EPEC strains with 1 typical EPEC strain and 10 atypical EPEC strains, 15 EAEC strains, 4 ETEC strains and 1 EIEC strain. EHEC were not detected. Result shows that EAEC and EPEC were the dominant bacteria type among diarrheagenicEscherichiacoli, which spread mainly among infants aging younger than 3 and adults aging up to 18 in Guiyang. Multi-PCR methods play an important role in diagnosis of diarrheagenicEscherichiacolidisease.

infectious diarrhea; diarrheagenicEscherichiacoli; multiplex PCR; virulence genes

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.020

貴州省衛(wèi)生廳科技基金(No.gzwkj2013-1-079);國家科技重大專項(No.2012ZX10004-212)聯(lián)合資助

貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴陽 550004； Email: weixyuse@gzscdc.org

Supported by the Science and Technology Fund of the Health Department of Guizhou Province (No. gzwkj2013-1-079) and grants from the National Key Program for Infectious Disease of China (No. 2012ZX10004-212)

R378.2

A

1002-2694(2015)09-0881-05

2014-10-11；

2015-01-23