張 菲，何 娜，王 穎，劉 曄，張守峰，扈榮良

貓用高效狂犬病滅活疫苗研究

張 菲，何 娜，王 穎，劉 曄，張守峰，扈榮良

目的 研制水包油新型佐劑狂犬病疫苗開展貓的免疫試驗。方法 利用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒鼬獾源性JX04-45株，病毒滴度達(dá)到107.5TCID50/mL以上的病毒培養(yǎng)物用于滅活和疫苗制備，佐劑為新型水包油型；通過本實驗室建立的熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定疫苗效力和貓免疫后的中和抗體，并進(jìn)行了攻毒試驗，評價本疫苗免疫效果。結(jié)果 一個劑量的疫苗免疫小鼠后FAVN方法測定的疫苗效力≥3.0 IU/劑量；水包油佐劑型狂犬病滅活疫苗免疫貓后14 d時無不良反應(yīng)，F(xiàn)AVN測得其誘導(dǎo)的中和抗體水平平均達(dá)16.04±4.29 IU/mL，28 d平均達(dá)37.13±6.12 IU/mL，56 d為21.01±7.61 IU/mL。180 d為6.71±3.44 IU/mL，360 d為2.66±2.01 IU/mL。至15個月時，咬肌攻毒106MIC LD50狂犬病病毒BD06株，觀察90 d試驗組無一死亡，對照組全部死亡。結(jié)論 本疫苗誘導(dǎo)長達(dá)1年的免疫保護(hù)，可擴(kuò)大安全評價和臨床試驗，以驗證其實用價值。

狂犬??；滅活疫苗；貓；中和抗體；攻毒試驗

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染引起的一種以腦脊髓炎為主要病理特征、感染后100%死亡的人獸共患傳染病[1-3]。

犬引起的人的狂犬病在我國人狂犬病病例中平均約占95%，是人狂犬病的主要傳播宿主[4]，但針對犬的狂犬病疫苗我國已批準(zhǔn)了5種以上滅活疫苗產(chǎn)品，另有4種進(jìn)口產(chǎn)品和2種弱毒疫苗[5]，因此犬的狂犬病疫苗基本上可以滿足我國犬免疫的需求。貓引起的人的狂犬病在我國不同地區(qū)所占比例為1%～9%不等，因此貓也是人狂犬病的重要傳播宿主之一。但在我國批準(zhǔn)的狂犬病弱毒疫苗和滅活疫苗中，針對貓的產(chǎn)品只有1種，且迄今未見正式生產(chǎn)和銷售。為此本實驗室利用分離的JX04-45株制備了一種水包油佐劑狂犬病滅活疫苗，并開展在貓的免疫試驗，取得良好的效果。

1 材料與方法

1.1 病毒株 用于狂犬病滅活疫苗制備的毒株為分離自鼬獾的JX04-45株[6]，在BHK-21細(xì)胞上增殖；用于攻毒用的強(qiáng)毒株為BD06，分離自河北保定的一只瘋?cè)?，在犬腦內(nèi)傳代；用于中和抗體測定的毒株為CVS-11，在BHK-21細(xì)胞上增殖。

1.2 細(xì)胞 用于病毒增殖的細(xì)胞為乳倉鼠腎傳代系BHK-21，培養(yǎng)基為含有2%血清、100 IU青霉素/mL、100 μg鏈霉素/mL、pH7.2的MEM(Invitrogen)。

1.3 動物 2～3 kg的家貓20只，購自長春市某養(yǎng)殖中心，熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)檢測貓的血清顯示，所有貓體內(nèi)均沒有狂犬病中和抗體。16～20 g昆明鼠20只，購自長春生物制品研究所?？袢?biāo)準(zhǔn)疫苗(11.6 IU/支)和標(biāo)準(zhǔn)血清(13.1 IU/mL)購自EDQM。

1.4 狂犬病滅活疫苗的制備 將JX04-45毒種按5%比例接種于BHK-21細(xì)胞上，于37 ℃培養(yǎng)至96 h，凍融2次后，按常規(guī)方法測定其半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。將107.5TCID50/mL以上的病毒培養(yǎng)物混合后，加入1/4 000的β-丙內(nèi)酯，4 ℃滅活24 h，37 ℃水浴中水解2 h，按1∶2的比例將特制的水包油佐劑加入滅活的病毒液中混勻，1.1 mL/瓶分裝，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 FAVN方法 利用本實驗室前期獲得的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體2株，采用常規(guī)方法制備異硫氰酸熒光黃標(biāo)記熒光抗體[7]。利用狂犬病毒滅活疫苗免疫犬1次，14 d后采集血清，制備抗狂犬病毒血清，并以O(shè)IE標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定，參考OIE指定方法，確定中和試驗程序。其中血清加入量減少為50 μL，樣品檢測設(shè)置2個重復(fù)。

1.6 疫苗效力測定 采用免疫小鼠-血清測定的方法：將20只約16 g的昆明小鼠隨機(jī)分成2組，采用胰島素注射器吸取待測疫苗50 μL，于后肢肌肉注射途徑接種，正常飼養(yǎng)至14 d時，摘除眼球，吸取小鼠血液，分離血清。

通過修飾的FAVN法測定各小鼠血清中的狂犬病中和抗體水平，修飾的FAVN方法主要不同在于：(1)血清加樣時每個樣品采用2個重復(fù)，減少一倍；(2)血清樣品用量50 μL，減少1倍；(3)FITC標(biāo)記抗體均為抗核蛋白單克隆抗體。測定出結(jié)果后，取中位數(shù)進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果判定待測疫苗的效力。

1.7 貓的免疫和抗體測定 隨機(jī)取10只貓，每只貓注射1個劑量的上述疫苗于后退肌肉，注射后密切觀察7 d后，如無異常，正常飼養(yǎng)，分別于接種前和接種后2、4、8周，180 d、360 d分別采集血清，通過FAVN方法測定抗體。對照貓不進(jìn)行任何處理，并同上采集血清測定。

1.8 攻毒試驗 將免疫貓和對照貓分別置于鐵籠內(nèi)隔離飼養(yǎng)，每只貓在咬肌注射BD06病毒2×105MIC LD50。觀察貓的臨床表現(xiàn)。攻毒貓在出現(xiàn)疑似狂犬病臨床表現(xiàn)時，采用安樂死的方式處理病貓，并采用上述熒光抗體對腦組織進(jìn)行染色檢測確診。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗效力 共制備病毒效價大于107.5/mL的細(xì)胞培養(yǎng)物4 000 mL，制備疫苗6 000 mL，分裝后制成疫苗5 385支。經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)疫苗(稀釋至3.0 IU/mL)和待測疫苗免疫10只小鼠后血清樣品中中和抗體效力的中位數(shù)分別為7.86 IU/mL和9.36 IU/mL，因此，待測疫苗的效力>3.0 IU/mL。10只小鼠測定的結(jié)果如表1。

2.2 免疫貓不同時間中和抗體測定結(jié)果 通過FAVN方法測定的10只免疫貓在免疫后不同時間的中和抗體結(jié)果如表2。

表1 疫苗效力檢測結(jié)果

2.3 攻毒試驗結(jié)果 10只免疫貓攻毒后在觀察的90 d內(nèi)無一出現(xiàn)異常臨床表現(xiàn)，試驗結(jié)束時未見任何貓死亡，全部獲得保護(hù)。對照的10只貓于攻毒后的11～32 d相繼死亡，經(jīng)FAT檢測進(jìn)一步確定為RABV感染。

3 討 論

本試驗采用的病毒株為本實驗室分離鑒定的JX04-45株，過去國內(nèi)研制狂犬病疫苗大部分采用國外引進(jìn)的疫苗株，如CVS-11、Flury-LEP、PV株等，有些則為國內(nèi)人用疫苗弱毒株滅活苗，如CTN等。JX04-45株系分離自鼬獾的街毒，經(jīng)過小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代后潛伏期縮短為7 d，在BHK-21細(xì)胞上具有穩(wěn)定和高滴度的復(fù)制能力。因此，本疫苗系首次采用國內(nèi)分離的狂犬病病毒高效毒株制備的貓用狂犬病滅活疫苗。

由于采用特制的水包油佐劑，疫苗免疫效力在抗原含量不需特別高的情況下即可在動物體內(nèi)誘導(dǎo)較高的抗體滴度，說明本佐劑可提高疫苗的效力。國內(nèi)批準(zhǔn)用于犬的狂犬病疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)示的效力分別為2.0 IU/劑量和2.5IU/劑量，后者至今未見投放市場。進(jìn)口的4種狂犬病疫苗效力均只在1-2IU/劑量范圍內(nèi)。本疫苗可以達(dá)到3.0 IU/mL的效力，是目前國內(nèi)動物用狂犬病疫苗效力中最高的。從抗體維持水平來看，犬用疫苗2.0 IU/劑量的效力在免疫后1年內(nèi)后約有80%的犬保持在有效保護(hù)水平內(nèi)，本疫苗免疫貓的抗體水平在1年后，100%(10/10)仍維持在保護(hù)水平以上。

表2 狂犬病新型佐劑疫苗在貓的免疫試驗

攻毒后，在陰性對照貓全部死亡的情況下，免疫貓全部健活。盡管犬用疫苗通常采用30條以上/組的犬進(jìn)行保護(hù)性試驗，但保持30條貓的數(shù)量相對于其種類來說數(shù)量較大；由于貓對狂犬病病毒的敏感性較高，故10只貓的數(shù)量盡管屬于中等數(shù)量的樣本，但從未免疫對照組的全部死亡結(jié)果來看，攻毒數(shù)量和兩組之間的顯著差異可以看出，本研究制備的狂犬病滅活疫苗具有完全的保護(hù)效果。

本研究采用的佐劑為水包油佐劑，與其他已報道的狂犬病滅活疫苗采用的鋁佐劑有所不同。該佐劑制備簡單，采用普通疫苗使用的白油即可。佐劑性狀為乳黃色水樣，使用(注射)時極為方便，值得在同類滅活疫苗中推廣。

本研究效力的測定采用免疫動物的中和抗體技術(shù)，而非采用小鼠攻毒試驗，這種技術(shù)為半定量技術(shù)，需將標(biāo)準(zhǔn)疫苗稀釋為期望的最低值，待測疫苗只要到該疫苗最低值疫苗所誘導(dǎo)的抗體水平，就可說明待測疫苗優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)疫苗所含的效力。但是由于該方法只能取試驗鼠血清測定結(jié)果的中位數(shù)或四分位數(shù)，而非全部鼠中和抗體的平均數(shù)，因此，也可能在一定條件下造成結(jié)果判定上的偏差。平均數(shù)在該類活體應(yīng)答的檢測中也不宜應(yīng)用，主要是因為個體對同一抗原的應(yīng)答水平相差懸殊，不適合平均數(shù)的統(tǒng)計學(xué)分析，同時本方法使用小鼠20只，期限縮短至16 d，取代了使用220只動物，耗時28 d的NIH方法，大大節(jié)省了費用。

[1]Official website of World Health Organization[EB/OL]. 世界衛(wèi)生組織官方網(wǎng)站 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/[EB/OL]

[2]The people’s Republic of China National Health and Family Planning Commission[EB/OL]. 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 http://www.moh.gov.cn/3.htm[EB/OL]

[3]Song M, Tang Q. Analysis of related factors of rabies epidemic in China[J]. Chin J Epidemiol, 2005, 26(3): 956-959. (in Chinese) 宋淼，唐青.中國狂犬病流行相關(guān)因素分析[J].中華流行病學(xué)雜志, 2005, 26(3):956-959.

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Hu Rong-liang, Email: ronglianghu@hotmail.com

Effective inactivated rabies vaccine for feline use

ZHANG Fei,HE Na,WANG Ying,LIU Ye,ZHANG Shou-feng,HU Rong-liang

(InstituteofVeterinarySciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130122,China)

In this study, we carried out immunity test in cats with a high effective rabies vaccine, which was developed with new oil-in-water adjuvant. By the fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) established in our laboratory, we assayed the efficacy of the vaccine in mice and monitored the neutralizing antibody level in cats after vaccination, and also challenged the cats to evaluate the immune effect of vaccine. Results showed that the efficacy of the vaccine tested in mice was to be more than 3.0 IU/dose and the vaccine had no adverse reaction in cats. The viral neutralizing antibody in cats was 16.04±4.29 IU/mL averagely 14 days post inoculation (dpi); 37.13±6.12 IU/mL, 28 dpi; 21.01±7.61 IU/mL, 56 dpi; 6.71±3.44 IU/mL, 180 dpi; 2.66±2.01IU/mL, 360 dpi. In 15 months, masseter muscle inoculation with 106MIC LD50of rabies virus BD06 strain was performed in cats. All cats in control group died after 90 days, while all in the vaccinated group survived, indicating the immune protection of the vaccine lasted for one year long.

rabies inactivated vaccine; cat; neutralizing antibody; challenge test

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.001

國家863課題(No.2012AA101303)資助

扈榮良，Email：ronglianghu@hotmail.com

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122

Supported by the National High Technology Research and Development Program (“863” program) of China (No. 2012AA101303)

R373

A

1002-2694(2015)08-0691-03

2014-07-18；

2014-11-21