弓 劍 閆素梅 史彬林 郭曉宇 金 鹿 郭詠梅

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特010022)

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二硝基氯苯抑制硫氧還蛋白還原酶活性誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型的建立

弓 劍1,2閆素梅1*史彬林1郭曉宇1金 鹿1郭詠梅1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，呼和浩特010022)

本試驗旨在利用硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)的抑制劑二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene,DNCB)作為刺激源，以細(xì)胞增殖率、TrxR活性和抗氧化指標(biāo)作為判斷依據(jù)，建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化損傷模型。試驗分2部分進(jìn)行。試驗1采用單因子完全隨機(jī)試驗設(shè)計，將第3代的BMEC隨機(jī)分為35組，每組8個重復(fù)。培養(yǎng)液中分別添加0(對照)、10、30、50、100、300和500 μmol/L的DNCB，使之分別作用細(xì)胞2、4、6、8和12 h，通過檢測細(xì)胞增殖率，初步確定適宜的作用時間；試驗2在試驗1得出適宜DNCB作用時間的基礎(chǔ)上，采用單因子隨機(jī)試驗設(shè)計，將BMEC隨機(jī)分為7組，每組6個重復(fù)，培養(yǎng)液中分別添加0(對照)、10、30、50、100、300和500 μmol/L的DNCB，通過檢測細(xì)胞TrxR活性以及抗氧化指標(biāo)，篩選出適宜的DNCB處理濃度。結(jié)果表明，與對照組相比，300 μmol/L DNCB作用2 h對BMEC產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激，細(xì)胞增殖率降到73.31%，TrxR活性降至56.23%，谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性也顯著降低(P<0.05)，丙二醛含量顯著提高(P<0.05)。結(jié)果提示，300 μmol/L的DNCB作用濃度和2 h的作用時間可作為建立細(xì)胞氧化損傷模型的適宜劑量與作用時間。

奶牛乳腺上皮細(xì)胞；二硝基氯苯；氧化損傷模型

奶牛由于泌乳期間乳腺有氧代謝活動加強(qiáng)以及大量乳的合成和分泌，往往會產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，導(dǎo)致乳腺產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對于高產(chǎn)奶牛表現(xiàn)尤為明顯[1]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)作為乳腺組織的主要構(gòu)成細(xì)胞，極易受到ROS的攻擊而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化功能降低，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖降低，乳產(chǎn)量下降[2]。因此，BMEC是建立奶牛乳腺氧化應(yīng)激模型的理想細(xì)胞，而建立一個可靠的BMEC氧化應(yīng)激模型，對于揭示其氧化應(yīng)激機(jī)制，研究有效的抗氧化措施，提高其抗氧化功能，進(jìn)而提高奶牛的產(chǎn)奶性能具有重要的意義。

目前多以過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)作為應(yīng)激源構(gòu)建細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型。二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene,DNCB)是一種親電子化合物，對硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)活性具有很強(qiáng)的抑制作用，主要通過使TrxR活性中心的硒代半胱氨酸殘基及其鄰近的半胱氨酸殘基烷基化，進(jìn)而導(dǎo)致TrxR活性降低或滅活[3-4]。在癌癥防治領(lǐng)域，主要是將DNCB作為一種藥物或氧化劑研究其對癌細(xì)胞的殺傷效果[5]。關(guān)于以DNCB作為應(yīng)激源建立細(xì)胞氧化損傷模型的研究甚少。通過DNCB抑制TrxR活性建立細(xì)胞氧化損傷模型的關(guān)鍵取決于DNCB的作用時間和濃度。Eriksson等[6]用20 μmol/L的DNCB作用人A549肺癌細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，TrxR活性顯著降低。Ade等[7]以12.5～50.0 μmol/L的DNCB作用人樹突細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，12.5 μmol/L的DNCB不影響細(xì)胞增殖率，25.0 μmol/L的DNCB導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降到75%，而當(dāng)濃度提高到50.0 μmol/L時，細(xì)胞增殖率降低到47%?？梢?，目前以DNCB誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究多集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而針對BMEC在該領(lǐng)域的研究未見有資料報道。因此，本試驗通過探討DNCB濃度和作用時間對BMEC增殖率、TrxR活性以及其他抗氧化指標(biāo)的影響，建立DNCB通過抑制TrxR活性誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生氧化應(yīng)激的細(xì)胞損傷模型，確定其適宜的作用時間和濃度，為進(jìn)一步深入探討B(tài)MEC的氧化應(yīng)激機(jī)制和抗氧化措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BMEC(膠原酶消化法培養(yǎng)制備)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液和雙抗(美國Gibco公司)；DNCB、氫化可的松、兩性霉素B和催乳素和表皮生長因子(美國Sigma公司)；3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(美國Amresco公司)；TrxR、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GPX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(北京碧云天公司)。

1.2 試劑配制

不同濃度DNCB貯備液的配制：準(zhǔn)確稱取2.025 6 g DNCB溶于10 mL DMSO溶液中，配制成1 000 mmol/L的DNCB原液，按試驗要求配制成不同濃度的DNCB儲備液(0、10、30、50、100、300、500 mmol/L)。

不同DNCB濃度細(xì)胞培養(yǎng)液的配制：取20 μL不同梯度濃度的DNCB貯備液加入到19.98 mL的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，使培養(yǎng)液中DNCB的濃度分別為0、10、30、50、100、300和500 μmol/L。將上述培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm的過濾器過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：于屠宰場挑選健康奶牛的乳腺組織，置于冰上，迅速帶回實(shí)驗室，用消毒手術(shù)剪剪去乳腺的外層組織，取深層組織塊放入含3×雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)的儲液瓶中，轉(zhuǎn)入超凈工作臺依次經(jīng)3×雙抗的PBS清洗3遍、75%乙醇溶液清洗30 s、1×雙抗的PBS清洗3遍。將清洗后的乳腺組織塊轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪剪去表面組織，在深層腺泡多的地方剪取約米粒大小的乳腺組織塊，放入5 mL離心管中，將離心管中的乳腺組織塊進(jìn)一步充分剪碎后加入0.5%的膠原酶Ⅱ，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，期間每隔20 min搖晃混合1次。消化液經(jīng)80目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，濾液在400×g條件下離心5 min，將離心所得沉淀用PBS懸浮，相同條件下繼續(xù)離心3 min，離心所得沉淀經(jīng)PBS重新懸浮，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，期間每隔24 h更換1次培養(yǎng)基。

傳代培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁率達(dá)80%～90%時，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL 0.05%的胰蛋白酶/EDTA，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化30 s，立即加入1 mL終止培養(yǎng)基終止消化，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS清洗后再加入1 mL胰蛋白酶/EDTA，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化10 min，立即加入1 mL終止培養(yǎng)基，反復(fù)吹打后全部轉(zhuǎn)入離心管，在400×g條件下離心5 min，所得細(xì)胞沉淀加入DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后再次接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，期間每隔24 h更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁率達(dá)80%～90%時，重復(fù)以上操作，如此傳代培養(yǎng)2次得到的乳腺上皮細(xì)胞，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

接種培養(yǎng)：將分離純化后的第3代BMEC分別以1×104和3×105個/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板(每孔200 μL)和60 mm培養(yǎng)皿(每皿3.5 mL)中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%時進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4 試驗設(shè)計

本試驗分2部分進(jìn)行。試驗1采用單因子完全隨機(jī)試驗設(shè)計，將上述接種于96孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞隨機(jī)分為35組，每組8個重復(fù)。培養(yǎng)液中分別添加0、10、30、50、100、300和500 μmol/L的DNCB，使之分別作用2、4、6、8和12 h，通過檢測細(xì)胞增殖率，初步確定適宜的作用時間。其中，0 μmol/L劑量組為對照組。

試驗2在試驗1得出適宜DNCB作用時間的基礎(chǔ)上，采用單因子隨機(jī)試驗設(shè)計，將上述接種于60 mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞隨機(jī)分為7組，每組6個重復(fù)，培養(yǎng)液中分別添加0、10、30、50、100、300和500 μmol/L的DNCB，通過檢測細(xì)胞中硒蛋白TrxR活性以及抗氧化指標(biāo)(GPX、SOD、CAT活性和MDA含量)，篩選出適宜的DNCB處理濃度。其中，0 μmol/L劑量組為對照組。

1.5 樣品采集與處理

細(xì)胞培養(yǎng)液：將60 mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液以處理和重復(fù)為單位分別收集于1.5 mL Eppendorf離心管中，于4 ℃、10 000×g條件下離心5 min，收集上清液用于SOD和CAT活性檢測。

細(xì)胞樣品：將收集細(xì)胞培養(yǎng)液后的60 mm培養(yǎng)皿置于冰上，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞刮起，加入1 mL動物細(xì)胞裂解液裂解30 min后于4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，收集上清液用于細(xì)胞中TrxR和GPX活性以及MDA含量的測定。

1.6 測定項目及方法

1.6.1 細(xì)胞增殖率

采用MTT法檢測[8]。將在96孔板中的BMEC按照試驗1的設(shè)計培養(yǎng)相應(yīng)時間后，每孔加入濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，使用全自動酶標(biāo)儀振蕩10 min后在波長490 nm處讀取溶液的吸光度值(OD)。各組的細(xì)胞增殖率用相對于對照組OD的百分比表示。對照組的細(xì)胞增殖率表示為100%。

細(xì)胞增殖率(%)=100×OD試驗組/OD對照組。

1.6.2 抗氧化指標(biāo)

TrxR和GPX活性采用二硫代二硝基苯甲酸還原法測定，SOD活性采用黃嘌呤氧化法測定，CAT活性采用鉬酸銨顯色法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。具體測定過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1 DNCB濃度與作用時間對細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，DNCB的添加濃度顯著影響了BMEC的增殖(P<0.05)，在所有作用時間下，隨著DNCB濃度的提高，細(xì)胞增殖率呈不同程度的降低趨勢。當(dāng)作用時間為2 h、DNCB濃度提高到300 μmol/L時，細(xì)胞增值率顯著降低(P<0.05)，較對照組降低了26.69%；進(jìn)一步提高DNCB濃度到500 μmol/L時，細(xì)胞增值率較對照組也顯著降低(P<0.05)，但與300 μmol/L相比無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，當(dāng)作用時間為4 h、DNCB濃度提高到50～500 μmol/L時，細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)，分別較對照組降低了18.50%、33.15%、61.92%和63.98%，其中100、300和500 μmol/L劑量組顯著低于50 μmol/L劑量組(P<0.05)，300和500 μmol/L劑量組顯著低于100 μmol/L劑量組(P<0.05)。當(dāng)作用時間延長至6、8、12 h時，30 μmol/L劑量組的細(xì)胞增殖率顯著低于對照組(P<0.05)，較對照組分別降低了23.53%、48.56%和71.93%，進(jìn)一步提高DNCB的濃度，細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)，當(dāng)DNCB濃度達(dá)到50 μmol/L及以上時，細(xì)胞增殖率均降到55%以下。

DNCB作用時間也顯著影響了BMEC的增殖(P<0.05)，在10～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著DNCB作用時間的增加，細(xì)胞相對增殖率呈不同程度的降低趨勢。當(dāng)DNCB添加濃度為10 μmol/L時，2～8 h的作用時間對細(xì)胞增殖率無顯著影響(P>0.05)，當(dāng)作用時間增加到12 h時，細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)，僅為31.79%。當(dāng)DNCB添加濃度為30 μmol/L時，2～4 h的作用時間對細(xì)胞增殖率無顯著影響(P>0.05)，當(dāng)作用時間增加到6～12 h時，隨時間增加，各時間點(diǎn)細(xì)胞增殖率依次顯著降低(P<0.05)，以作用12 h時的細(xì)胞增殖率最低。當(dāng)DNCB濃度提高到50～500 μmol/L時，作用時間為4 h即可導(dǎo)致細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)，且當(dāng)作用時間增加到6～12 h時，隨時間增加，各時間點(diǎn)細(xì)胞增殖率依次顯著降低(P<0.05)。

其中，細(xì)胞增殖率在70%～80%范圍內(nèi)，DNCB的濃度與作用時間分別為300 μmol/L作用2 h、500 μmol/L作用2 h和30 μmol/L作用6 h，對應(yīng)的細(xì)胞增殖率分別為73.31%、72.88%和76.47%。

表1 DNCB濃度和作用時間對BMEC增殖率的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and those in the same row with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2 DNCB濃度對細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可知，隨著DNCB處理濃度的提高，細(xì)胞TrxR活性呈不同程度的降低趨勢。與對照組相比，10、30 μmol/L的DNCB處理對細(xì)胞TrxR活性無顯著影響(P>0.05)；當(dāng)DNCB處理濃度增加到50～100 μmol/L時，細(xì)胞TrxR活性顯著降低(P<0.05)，50和100 μmol/L劑量組之間無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)處理濃度進(jìn)一步提高到300、500 μmol/L，細(xì)胞TrxR活性顯著低于其他各組(P<0.05)，300和500 μmol/L劑量組之間無顯著差異(P>0.05)。

此外，隨著DNCB處理濃度的提高，GPX、CAT和SOD活性呈先增后降的趨勢。相對于對照組，10和30 μmol/L劑量組GPX、CAT和SOD活性在數(shù)值上有所提高，但組間差異不顯著(P>0.05)。對于50 μmol/L的DNCB劑量組，除CAT活性顯著低于10和30 μmol/L劑量組外，其他指標(biāo)均與10和30 μmol/L劑量組間無顯著差異(P>0.05)。100 μmol/L劑量組GPX、CAT和SOD活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于10和30 μmol/L劑量組(P<0.05)；當(dāng)DNCB處理濃度進(jìn)一步提高到300、500 μmol/L時，GPX、CAT和SOD的活性顯著低于其他各組(P<0.05)，但300和500 μmol/L劑量組之間無顯著差異(P>0.05)。

隨著DNCB處理濃度的提高，細(xì)胞MDA含量呈先降后增的趨勢。10 μmol/L劑量組與對照相比MDA含量有所降低，但無顯著差異(P>0.05)，當(dāng)作用濃度提高到30～100 μmol/L時，細(xì)胞MDA含量開始提高，但與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，而當(dāng)作用濃度進(jìn)一步提高到300、500 μmol/L時，MDA含量顯著高于對照組以及10和30 μmol/L劑量組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 DNCB濃度和作用時間對細(xì)胞增殖的影響

齊曉龍等[9]的研究認(rèn)為，細(xì)胞增殖率過高或過低均不利于研究一些抗氧化劑對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，增殖率過高說明沒有對細(xì)胞造成明顯的氧化損傷，過低說明對細(xì)胞造成不可恢復(fù)的損傷。一些用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的模型研究認(rèn)為，細(xì)胞增殖率以不低于70%、不高于80%為宜[10-11]。Andoh等[12]以5、10和50 μmol/L的DNCB作用人SH-SY5Y細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖率分別降低到30%、50%和75%。Ade等[7]研究發(fā)現(xiàn)，25和50 μmol/L DNCB作用24 h后人神經(jīng)樹突細(xì)胞的增殖率顯著降低，分別降低到75%和47%，認(rèn)為在該試驗條件下細(xì)胞增殖率為75%適宜于后續(xù)試驗的開展。本試驗結(jié)果表明，300、500 μmol/L的DNCB作用2 h導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降低到73.31%左右，50、100 μmol/L的DNCB作用4 h導(dǎo)致細(xì)胞增殖率分別降低到約81.50%和66.85%，30 μmol/L的DNCB作用6 h導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降低到76.67%，而引起細(xì)胞增殖率顯著降低的其余各組合均導(dǎo)致細(xì)胞增殖率降低到55%以下。由此可見，以細(xì)胞增殖率在70%～80%范圍作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，可選擇30 μmol/L作用6 h或300、500 μmol/L作用2 h作為適宜的濃度和作用時間?？紤]到500與300 μmol/L劑量組間差異不顯著，本試驗根據(jù)細(xì)胞增殖結(jié)果初步得出，以DNCB為應(yīng)激源建立細(xì)胞氧化損傷模型時，30 μmol/L作用6 h和300 μmol/L作用2 h均可作為細(xì)胞氧化損傷的適宜刺激濃度與作用時間。

表2 DNCB濃度對BMEC抗氧化指標(biāo)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 DNCB作用濃度對細(xì)胞TrxR活性的抑制作用

DNCB作為一種親電子化合物對TrxR的活性具有很強(qiáng)的抑制作用，主要通過使TrxR活性中心的硒代半胱氨酸殘基及其鄰近的半胱氨酸殘基烷基化導(dǎo)致其活性降低或滅活[13]。當(dāng)TrxR活性降低或被抑制時，可激活細(xì)胞凋亡信號激酶，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[14]。因此，TrxR活性被抑制的程度與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可作為反映細(xì)胞是否發(fā)生氧化應(yīng)激的重要判定指標(biāo)。DNCB對TrxR活性的抑制作用與其濃度存在劑量依賴關(guān)系。用不同濃度(0～10 μmol/L)DNCB處理小鼠心臟線粒體的研究表明，隨著DNCB處理濃度的提高，TrxR活性逐漸降低，當(dāng)DNCB濃度為10 μmol/L時，TrxR活性降到70%[15]。然而關(guān)于TrxR的降低程度達(dá)到多少適宜于氧化建模沒有具體的評價標(biāo)準(zhǔn)。本試驗以BMEC為對象的研究結(jié)果表明，與對照組相比，DNCB 10、30 μmol/L劑量組對TrxR活性無顯著的抑制作用，但50、100 μmol/L劑量組細(xì)胞TrxR活性顯著降低，分別為對照組的75.99%和73.56%；當(dāng)DNCB濃度增加到300、500 μmol/L時，TrxR活性進(jìn)一步降低，分別降低到56.23%和54.41%。如果以細(xì)胞增殖率為70%～80%作為初步的判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)DNCB的濃度為300 μmol/L、作用時間為2 h時，細(xì)胞增殖率降低到73.31%，此時TrxR活性降低到原來的56.23%。由此初步得出，DNCB對細(xì)胞TrxR活性的抑制程度達(dá)到43%以上時，可能會引起B(yǎng)MEC的氧化損傷，細(xì)胞增殖顯著下降。

3.3 DNCB作用濃度對細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

如前所述，本試驗以細(xì)胞增殖率初步篩選得出，DNCB的濃度為300 μmol/L、作用時間為2 h時，細(xì)胞增殖率降低到73.31%，此時TrxR活性降低到56.23%，但細(xì)胞是否發(fā)生了顯著的氧化損傷尚不清楚。GPX、SOD、CAT活性以及MDA含量是反映細(xì)胞是否發(fā)生氧化應(yīng)激的重要判定指標(biāo)。目前，關(guān)于DNCB對細(xì)胞上述抗氧化指標(biāo)的影響未見有資料報道。用其他TrxR抑制劑(環(huán)磷酰胺)的研究發(fā)現(xiàn)，TrxR活性顯著降低的同時，SOD、GPX和CAT的活性也顯著降低[16]。本研究結(jié)果表明，300、500 μmol/L的DNCB作用于細(xì)胞2 h，可引起GPX、SOD和CAT活性的顯著降低，MDA含量的顯著提高，但300和500 μmol/L劑量組之間差異不顯著。由此可見，300 μmol/L DNCB作用于細(xì)胞2 h即可對BMEC產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，可以作為建立氧化損傷模型時的處理濃度與處理時間，此時對TrxR活性的抑制程度達(dá)到43%以上；處理濃度再繼續(xù)增加，相關(guān)指標(biāo)的組間無顯著差異，即細(xì)胞的氧化損傷程度不再繼續(xù)增加。

4 結(jié) 論

當(dāng)DNCB作用濃度為300 μmol/L、作用時間為2 h時，細(xì)胞增殖率顯著降低，TrxR活性受到顯著抑制，引起細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，可作為建立細(xì)胞氧化損傷模型的適宜劑量和作用時間。

[1] VALKO M,LEIBFRITZ D,MONCOL J,et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2007,39(1):44-54.

[3] NORDBERG J,ZHONG L,HOLMGREN A,et al.Mammalian thioredoxin reductase is irreversibly inhibited by dinitrohalobenzenes by alkylation of both the redox active selenocysteine and its neighboring cysteine residue[J].Journal of Biological Chemistry,1998,273(18):10835-10842.

[4] CAI W Q,ZHANG L W,SONG Y L,et al.Small molecule inhibitors of mammalian thioredoxin reductase[J].Free Radical Biology and Medicine,2012,52(2):257-265.

[5] ISHIKAWA A,KUBOTA Y,MURAYAMA T,et al.Cell death by 1-chloro-2,4-dinitrobenzene,an inhibitor of thioredoxin reductase and its dual regulation by nitric oxide in rats[J].Neuroscience Letters,1999,277(2):99-102.

[6] ERIKSSON S E,PRAST-NIELSEN S,FLABERY E,et al.High levels of thioredoxin reductase 1 modulate drug-specific cytotoxic efficacy[J].Free Radical Biology and Medicine,2009,47(11):1661-1671.

[7] ADE N,ANTONIOS D,KERDINE-ROMER S,et al.NF-κB plays a major role in the maturation of human dendritic cells induced by NiSO4but not by DNCB[J].Toxicological Sciences,2007,99(2):488-501.

[8] 金鹿,閆素梅,史彬林,等.過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2014,26(12):3651-3658.

[9] 齊曉龍,趙芹,張亞男,等.過氧化氫誘導(dǎo)產(chǎn)蛋雞原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立[J].中國畜牧雜志,2013,49(11):49-52.

[10] 周麗娜.野木瓜注射液及野木瓜提取物對H2O2氧化損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用[D].碩士學(xué)位論文.上海:上海師范大學(xué),2011:26-47.

[11] 孫婧陶,李兆華,張寶修,等.過氧化氫誘導(dǎo)延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(10):149-152.

[12] ANDOH T,CHOCK P B,CHIUEH C C.The roles of thioredoxin in protection against oxidative stress-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277:9655-9660.

[13] RANDALL M J,SPIESS P C,HRISTOVA M,et al.Acrolein-induced activation of mitogen-activated protein kinase signaling is mediated by alkylation of thioredoxin reductase and thioredoxin 1[J].Redox Biology,2013,1(1):265-275.

[14] SOGA M,MATSUZAWA A,IGCHIJO H.Oxidative stress-induced diseases via the ASK1 signaling pathway[J].International Journal of Cell Biology,2012,2012:439587.

[15] STANLEY B A,SIVAKUMARAN V,SHI S,et al.Thioredoxin reductase-2 is essential for keeping low levels of H2O2emission from isolated heart mitochondria[J].Journal of Biological Chemistry,2011,286(38):33669-33677.

[16] WANG X F,ZHANG J S,XU T W.Cyclophosphamide as a potent inhibitor of tumor thioredoxin reductaseinvivo[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007,218(1):88-95.

*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Establishment of Oxidative Damage Model of Bovine Mammary Epithelial Cells Induced by Dinitrochlorobenzene Inhibiting Thioredoxin Reductase Activity

GONG Jian1,2YAN Sumei1*SHI Binlin1GUO Xiaoyu1JIN Lu1GUO Yongmei1

(1.CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,InnerMongoliaNormalUniversity,Hohhot010022,China)

Dinitrochlorobenzene (DNCB) was selected as the inhibitor of thioredoxin reductase (TrxR) activity to induce oxidative damage of bovine mammary epithelial cells (BMECs), and oxidative damage model was established by detecting cell proliferation rate, TrxR activity and antioxidant parameters in BMECs. The experiment was divided into two parts. The experiment 1 was conducted as a single factor randomized arrangement, and the 3th passage BMECs were divided into 35 groups with 8 replicates in each group. Cells were incubated with culture medium containing different concentrations of DNCB [0 (control), 10, 30, 50, 100, 300 and 500 μmol/L] for 2, 4, 6, 8 and 12 h to determine the appropriate action time of DNCB by detecting the cell proliferation rate. Based on the results in experiment 1, the experiment 2 was conducted as a single factor randomized arrangement, and the cells were divided into 7 groups with 6 replicates in each group. Cells were incubated with culture medium containing different concentrations of DNCB [0 (control), 100, 200, 400, 600, 800 and 1 000 μmol/L] for 2 h to select the appropriate concentration of DNCB by measuring TrxR activity and antioxidant parameters. The results showed that compared with control group, the group of 300 μmol/L DNCB for 2 h resulted in significant oxidative damage of BMECs, and cell proliferation rate reduced to 73.31%, TrxR activity decreased to 56.23%, the activities of glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase also significantly decreased (P<0.05), and malondialdehyde content significantly increased (P<0.05). The results indicate that DNCB concentration of 300 μmol/L and the time of 2 h can be selected as the appropriate action concentration and time to establish the oxidative damage model of BMECs.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3984-3990]

bovine mammary epithelial cells; dinitrochlorobenzene; oxidative damage model

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.041

2015-07-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(31160466);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012BAD12B09-03)

弓 劍(1975—)，男，內(nèi)蒙古涼城人，講師，博士，主要從事動物礦物質(zhì)與維生素營養(yǎng)研究。E-mail： gongjian3021@sina.com

*通信作者：閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S826

A

1006-267X(2015)12-3984-07