丁江華，袁利亞，陳國安

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多發(fā)性骨髓瘤實(shí)驗(yàn)專題

·論著·

建立人多發(fā)性骨髓瘤NOD/SCID小鼠皮下移植瘤動物模型

丁江華，袁利亞，陳國安

目的 探討建立人多發(fā)性骨髓瘤(MM)NOD/SCID小鼠皮下移植瘤動物模型的方法。方法 在NOD/SCID小鼠皮下接種1×107個人MM細(xì)胞株(MM1.S或RPMI-8226)，每3～4 d記錄小鼠體重、腫瘤體積及生存期；如腫瘤生長超過規(guī)定最大徑仍未死亡，即處死小鼠，取其皮下移植瘤進(jìn)行病理檢測與CD138免疫組化染色。結(jié)果 總成瘤率為75%(9/12)；荷瘤小鼠皮下移植瘤形成的高峰時間為接種后第15～18天，瘤體體積在接種后第35～40天達(dá)高峰，平均體積分別為1710.8 mm3(MM1.S組)與1749.5 mm3(RPMI-8226組)；NOD/SCID小鼠在荷瘤后第13～14天即開始有死亡，生存期最長達(dá)38～42 d，兩組小鼠的中位生存時間均為荷瘤后28 d；皮下移植瘤病理檢測與CD138檢測證實(shí)瘤組織為漿細(xì)胞來源。結(jié)論 于NOD/SCID小鼠皮下接種人MM細(xì)胞(1×107個)，建立人MM移植瘤動物模型成功率高，且無須射線預(yù)處理、技術(shù)要求較低、操作過程簡單及瘤體觀察方便，可作為MM動物實(shí)驗(yàn)研究的主要模型之一。

多發(fā)性骨髓瘤；NOD/SCID小鼠；模型,動物；腫瘤移植

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)屬起源于漿細(xì)胞的惡性腫瘤，約占血液腫瘤的13%，居血液腫瘤第2位。近10年來，MM治療盡管取得了長足的進(jìn)展，但至今為止MM仍屬不可治愈性疾病。通過建立動物模型探討MM的藥物治療與方法，成為MM研究的關(guān)鍵步驟。目前，由于非糖尿病性肥胖/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠具有T、B、NK細(xì)胞缺陷，已廣泛用于建立各種實(shí)體腫瘤的動物模型，但目前在血液腫瘤中的應(yīng)用研究尚少。因此，我們通過接種骨髓瘤細(xì)胞懸液于NOD/SCID小鼠皮下的方法，建立人MM移植瘤動物模型，成瘤率達(dá)75%，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(雙抗)、胎牛血清(FBS)等購自美國Gibco公司。CD138抗體為鼠源性抗體，購自長沙艾佳生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 NOD/SCID小鼠SPF級12只，雄性，鼠齡4周，體重18～22 g，購于北京華阜康生物科技公司[許可證號：SCXK(京)2009-0004]。嚴(yán)格飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室中，室溫保持在22～24℃，濕度保持在50%～55%，光線控制為明暗交替(12 h明與12 h暗)，飼料經(jīng)60Co照射，墊料與飲用水均經(jīng)高壓滅菌處理。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) MM1.S細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院邱錄貴教授惠贈；RMPI-8226細(xì)胞株由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科趙小英教授惠贈。MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS、青霉素與鏈霉素組成的完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4 NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立

1.4.1 小鼠備皮準(zhǔn)備：根據(jù)文獻(xiàn)報道[1]，4%硫化鈉對實(shí)驗(yàn)表皮損傷最小。于接種前2天，選取小鼠左或右前肢背部皮膚，用棉簽蘸取4%硫化鈉溶液輕輕涂抹皮膚進(jìn)行備皮。

1.4.2 制備瘤細(xì)胞懸液：分別收集MM1.S與RPMI-8226細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次去除胎牛血清，PBS重懸細(xì)胞以臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞活力在95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為10×107/ml。

1.4.3 瘤細(xì)胞皮下接種：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在每點(diǎn)接種腫瘤細(xì)胞絕對數(shù)1×107個(即100 μl瘤細(xì)胞懸液)，注意防止抽針后針孔外溢。根據(jù)接種細(xì)胞類型分組，分為MM1.S組與RPMI-8226組，每組接種6只小鼠。

1.5 荷瘤小鼠指標(biāo)的監(jiān)測

1.5.1 一般情況：觀察兩組小鼠的精神、活動情況，每3～4 d記錄小鼠的體重、腫瘤體積、腫瘤破潰及死亡情況。

1.5.2 腫瘤體積：每3～4 d使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大徑(a)與最小徑(b)，按如下公式計(jì)算腫瘤體積：V=1/2×ab2。

1.5.3 生存期：在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)移植瘤最大徑超過3.5 cm時，荷瘤小鼠即呈現(xiàn)明顯消瘦、食差、行動過于遲緩等惡病質(zhì)，即行頸椎脫臼處死小鼠。因此，生存期從荷瘤小鼠移植瘤形成開始，至小鼠自然死亡或處死為止。

1.6 荷瘤小鼠皮下移植瘤的病理檢測 實(shí)驗(yàn)小鼠處死后取小鼠的腫瘤組織，分別用于細(xì)胞印片行瑞氏染色、石蠟切片行HE染色，以及CD138免疫組化染色為證實(shí)為漿細(xì)胞來源腫瘤。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，直接觀察指標(biāo)采用描述性分析，腫瘤體積以均數(shù)表示，生存時間以中位數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠腫瘤生長情況 在接種后5 d內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)小鼠接種部位可見圓形的小皮丘，直徑為3～5 mm，而后于接種后第7～10天內(nèi)逐漸消失。期間小鼠精神、活動正常，體重仍呈上升趨勢。

在接種后第15～18天，9只小鼠(即MM1.S組5只，RPMI-8226組4只)形成肉眼可見的橢圓形或圓形皮下腫塊，直徑為5～8 mm，成瘤率為75%(9/12)。此時，小鼠漸出現(xiàn)精神變差、活動緩慢、消瘦等情況。隨時間延長移植瘤體積逐漸增大，在接種后第35～40天小鼠腫瘤體積達(dá)高峰，兩組移植瘤平均體積分別為1710.8 mm3(MM1.S組)與1749.5 mm3(RPMI-8226組)，此時小鼠精神變差、明顯消瘦、行動過于遲緩，部分移植瘤開始出現(xiàn)破潰壞死，見圖1、2。

圖1 兩組NOD/SCID小鼠皮下移植瘤體積變化

2.2 荷瘤小鼠生存期 對形成移植瘤的小鼠進(jìn)行生存期分析，發(fā)現(xiàn)在接種后第13～14天即開始有小鼠死亡，生存期最長達(dá)38～42 d。兩組小鼠的中位生存時間均為接種后28 d，見圖3。

圖2 兩組NOD/SCID小鼠皮下移植瘤大體觀察A、B為MM1.S組小鼠；C、D為RPMI-8226組小鼠

2.3 荷瘤小鼠移植瘤病理檢測 完整取下實(shí)驗(yàn)小鼠的移植瘤組織，分別行瑞氏染色與HE染色，鏡下發(fā)現(xiàn)有成團(tuán)或成巢分布的瘤細(xì)胞，CD138免疫組化染色顯示強(qiáng)陽性，見圖4、5。

圖3 兩組荷瘤小鼠生存期分析

圖4 荷瘤小鼠移植瘤組織鏡下病理形態(tài)

A.MM1.S組(瑞氏染色×400);B.MM1.S組(HE×1000);C.RPMI-8226組(瑞氏染色×400);D.RPMI-8226組(HE×1000)

圖5 荷瘤小鼠移植瘤組織免疫組化結(jié)果

3 討論

建立動物模型是實(shí)驗(yàn)研究最常用的方法。目前，MM動物模型主要包括兩種：①皮下移植瘤動物模型；②人胎骨植入移植瘤動物模型。其中，前者由于取材簡便、操作簡單、觀察直觀等優(yōu)點(diǎn)，已成為廣泛應(yīng)用的MM動物模型，而后者主要用于研究MM骨病。目前，在動物方面可選擇裸鼠、Babl/c小鼠、SCID小鼠及NOD/SCID小鼠等。多數(shù)研究顯示，與實(shí)體腫瘤移植瘤相比，作為血液腫瘤的MM，移植瘤成瘤率約8%～40%，成為制約MM實(shí)驗(yàn)研究的主要因素[2]。因此，提高M(jìn)M移植瘤成瘤率是迫切需要解決的重要課題。1959年Merwin和Algire[3]首次在Babl/c小鼠中通過腹腔內(nèi)植入塑膠建立了MM動物模型。盡管這種小鼠模型分泌的單克隆蛋白(僅為IgA)與人MM細(xì)胞所分泌的單克隆蛋白(多數(shù)為IgG)存在明顯差異性，但仍是當(dāng)時最好的MM動物模型[4]。在1985年發(fā)現(xiàn)在衰老的C57BL/KaLwRij品系小鼠中存在自發(fā)的MM疾病，被命名為5T骨髓瘤模型[5]。由于該模型僅少數(shù)分泌IgG球蛋白，多數(shù)分泌IgA，且成瘤率<10%，因此在MM實(shí)驗(yàn)研究中的意義有限[6]。隨后，有學(xué)者建立了Myc/Bcl-Xl雙轉(zhuǎn)基因MM小鼠動物模型[7]?？上У氖?，在該小鼠模型中romidepsin顯示強(qiáng)抗MM作用，但在人MM病例中卻未觀察到抗癌作用[8]。值得關(guān)注的是，這種模型同時合并淋巴瘤的發(fā)生率高達(dá)30%～40%[9]，與臨床MM病例的發(fā)病特征不相符，因此逐漸被研究者放棄。SCID小鼠存在T與B淋巴細(xì)胞缺陷，先后應(yīng)用于建立腹腔MM模型、移植瘤MM模型與人胎骨植入MM模型。由于SCID小鼠還具有正常的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(M )與淋巴因子激活細(xì)胞(LAK)的功能，一定程度上可降低瘤細(xì)胞植入成活率[10]。據(jù)文獻(xiàn)報道，在SCID小鼠中MM動物模型的成瘤率約30%～40%[11-12]。

NOD/SCID小鼠是在SCID小鼠的基礎(chǔ)上與NOD小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。NOD/SCID小鼠既有NK細(xì)胞與補(bǔ)體C5缺乏，又有T和B淋巴細(xì)胞缺乏，且較少發(fā)生排斥反應(yīng)及移植物抗宿主病(GVHD)，所以逐漸成為血液學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的常用動物。王雅丹等[13]通過射線預(yù)照射與骨髓瘤細(xì)胞懸液(RPMI-8226)接種的方法，在5只NOD/SCID小鼠中成功建立了MM荷瘤小鼠模型。然而，NOD/SCID小鼠對放射高度敏感，4 Gy射線照射后即可導(dǎo)致造血系統(tǒng)衰竭而死亡，而且可能導(dǎo)致MM細(xì)胞彌漫性浸潤(如胃腸道)，一定程度上增加了荷瘤NOD/SCID小鼠的自然死亡率，對于實(shí)驗(yàn)研究特別是觀察藥物療效有時反而不利[14-16]。

因此，我們嘗試單用瘤細(xì)胞接種的方法，對NOD/SCID小鼠進(jìn)行MM1.S與RPMI-8226兩種骨髓瘤細(xì)胞皮下接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植瘤成功率達(dá)75%(9/12)。此外，對于NOD/SCID小鼠長出的移植瘤進(jìn)行病理與CD138染色，結(jié)果表明采用單獨(dú)瘤細(xì)胞接種方法，在NOD/SCID小鼠中完全可以建立MM移植瘤動物模型，且成瘤率非常高。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了兩種具有K-Ras突變的MM細(xì)胞株，即地塞米松敏感株(MM1.S)與地塞米松耐藥株(RPMI-8226)，均成功地建立了移植瘤模型。徐冰等[17]在NOD/SCID小鼠中建立了肝癌移植瘤動物模型，成瘤率為100%。研究表明：NOD/SCID小鼠對不同瘤細(xì)胞類型均具有極高的成瘤率。相比SCID小鼠而言，NOD/SCID小鼠成瘤率顯著升高。分析原因可能與NOD/SCID小鼠極少發(fā)生免疫滲漏(<10%)，而SCID小鼠免疫滲漏發(fā)生率達(dá)90%[18]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)單用瘤細(xì)胞接種方法，在NOD/SCID小鼠中成功地建立了MM移植瘤動物模型，且皮下移植瘤經(jīng)病理與CD138染色證實(shí)為MM細(xì)胞。不過，本實(shí)驗(yàn)也存在不足：皮下移植瘤的MM模型并不能完全模擬MM的病理生理發(fā)生過程。但是，關(guān)于在免疫正常/缺陷小鼠中人MM細(xì)胞特異性歸巢并在骨髓中增殖的移植瘤模型，至今報道較少[19]。本實(shí)驗(yàn)所采用的方法無須射線預(yù)處理，具有技術(shù)要求較低、操作過程簡單、瘤體觀察方便等優(yōu)點(diǎn)，可作為MM動物實(shí)驗(yàn)研究的主要模型之一。

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Establishment of Subcutaneous Xenograft Models of Human Multiple Myeloma in NOD/SCID Mice

DING Jiang-hua1, YUAN Li-ya2, CHEN Guo-an3

(1. Department of Hematology and Oncology, 171 Hospital of the PLA, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 2. Hematology Institution, Academy of Medical Science of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China; 3. Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To investigate the establishment method of subcutaneous xenograft models of human multiple myeloma (MM) in nonobese diabetic/serious combined immunodeficiency disease (NOD/SCID) mice. Methods A total of 1×107cell lines (MM1.S or RPMI-8226) were subcutaneously injected into NOD/SCID mice, and the body weight, tumor volume and survival time were recorded every 3-4 d. The mice would be sacrificed if the ones with the biggest tumor diameter were still alive, and the xenografts were taken off to observe pathology and CD138 immune-histochemical staining. Results The total rate of tumor formation was 75% (9/12). The peak time of xenograft formation was found in 15th-18thd after injection in NOD/SICD mice. The maximum of tumor volume occurred in the 35th-40thd after injection, and the mean volume of xenografts for MM1.S and RPMI-8226 cells were 1710.8 mm3and 1749.5 mm3respectively. The initial death occurred in the 13th-14thd, and the longest survival time was 38th-42thd after NOD/SCID mice began to carry xenografts. The median overall survival time was 28 d in the two groups. The pathology and CD138 immune-histochemical staining showed that the tissues came from plasma cells. Conclusion The subcutaneous xenograft models can be established using the method of injecting myeloma cells (1×107) into NOD/SCID mice without irradiation pretreatment with a high successful rate, which may be used as one of the main animal models for MM study.

Multiple myeloma; Nonobese diabetic/serious combined immunodeficiency disease mice; Models, animal; Neoplasm transplantation

國際合作專項(xiàng)基金(2011DFA32820)；國家自然科學(xué)基金(81460037)

332000 江西 九江，解放軍171醫(yī)院血液腫瘤科(丁江華)；330006 南昌，江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院血液研究所(袁利亞)；330006 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科(陳國安)

陳國安，E-mail:gachen923@hotmail.com

R-332

A

2095-140X(2015)03-0041-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.03.010

2014-11-12 修回時間：2015-01-09)