錢奎梅，劉 霞，陳宇煒

(中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

淡水浮游植物計數(shù)與定量方法*

錢奎梅，劉 霞，陳宇煒**

(中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

顯微鏡計數(shù)法是淡水浮游植物計數(shù)最常用的經(jīng)典方法，是浮游植物生物量測定的基本方法，也是衡量其他測定方法準確性的依據(jù).隨著科技的發(fā)展，可見分光光度法、熒光分光光度法、流式細胞顯微鏡計數(shù)法、庫爾特計數(shù)法等新型細胞計數(shù)法相繼問世.對各種方法的特點進行比較，結果表明：光密度法、流式攝像機計數(shù)法、流式細胞儀法、葉綠素a法等僅能夠分析測定浮游植物生物量，而顯微鏡法是測量浮游植物粒徑的經(jīng)典方法，不僅可以測定浮游植物生物量，還可以進行浮游植物的種類及群落結構分析.以上這些方法都可以用于浮游植物的計數(shù)與定量，可以根據(jù)不同的需求來選擇最佳的浮游植物計數(shù)方法，如分析方便性、樣本處理速率、樣本大小等.但顯微鏡計數(shù)法在淡水生態(tài)學中具有不可替代的作用.

浮游植物；細胞計數(shù)；生物量；顯微鏡；定量

浮游植物是一個生態(tài)學概念，是指在水體中營浮游生活的微小植物，通常浮游植物就是指浮游藻類，包括藍藻門、綠藻門、硅藻門、金藻門、黃藻門、甲藻門、隱藻門和裸藻門8個門類的浮游種類，已知全世界藻類植物約有40000種，其中淡水藻類有25000種左右，而中國已發(fā)現(xiàn)的淡水藻類約9000種[1].浮游植物是水域生態(tài)系統(tǒng)的重要初級生產(chǎn)者，其種類組成和數(shù)量分布的生態(tài)學特征是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要研究內容[2].由于浮游植物對其所處生境的水質狀況反應靈敏，能夠對水體營養(yǎng)狀態(tài)的變化迅速做出響應[3]，其群落結構能夠真實地反映水質狀況，是評價水體健康狀況的重要指示生物[4].

浮游植物現(xiàn)存量是指某一瞬間單位水體中所存在的浮游植物的總量[5].這個量用數(shù)量表示稱為豐度，用重量表示稱為生物量.由于不同水體、不同種類的藻類在個體上差異較大(這種差異有時可達數(shù)百、數(shù)千倍)，有些在豐度上較高的種類由于個體微小，生物量可能低于豐度小而個體大的種類，所以用細胞豐度來表示生物量會過高估計細胞體積小的物種的貢獻，過低估計細胞體積大的物種的貢獻，因此，僅用豐度就很難全面評價不同水體浮游植物的真實情況，而且細胞豐度對于分析浮游植物現(xiàn)存量在食物鏈和營養(yǎng)對策等方面所起的作用也是有限的，應該以測算生物量為目標.

浮游植物生物量還可以通過測定葉綠素、ATP、碳含量、氮含量等方法(如化學分類方法、基于光譜的檢測方法以及分子生物學鑒定與檢測技術等)獲得[6-7]，也可通過間接從細胞體積轉化為生物量而獲得.除細胞體積轉化外，其它方法可從不同角度獲得較精確的浮游植物現(xiàn)存量，但它們無法反映浮游植物的群落結構和不同種及同種不同大小的浮游植物生物量的貢獻，從而無法解釋現(xiàn)存量時空變化的內在原因.只有通過測量浮游植物細胞個體大小獲得細胞體積轉化后的生物量，才能既較準確地反映浮游植物現(xiàn)存量，又能清楚地了解浮游植物的群落結構、種類組成、優(yōu)勢種、種類交替及不同大小細胞對浮游植物生物量的貢獻.

隨著科技的發(fā)展，浮游植物細胞定量計數(shù)方法除傳統(tǒng)的顯微鏡計數(shù)[5]外，可見分光光度法、熒光分光光度法、流式細胞顯微鏡計數(shù)法[8-10]、庫爾特計數(shù)法[11]等相繼問世，這些方法很多都源于海洋浮游植物分析，可在淡水中推廣應用，因此，本文對這些方法進行綜述.

1 浮游植物分析方法

1.1 基于形態(tài)學特征的分析方法

運用光學顯微鏡對浮游植物進行定性、定量分析是當前鑒別和計量浮游植物最直接和可信的方法，是浮游植物分類鑒定的基礎[5,12]，也是檢驗其他測定方法有效性的依據(jù).1931年Uterm?hl在結合Volk的靜置沉淀法與Kolkwitz的計數(shù)框基礎上發(fā)明了Uterm?hl計數(shù)法[13].1958年，Uterm?hl又規(guī)范了計數(shù)框的觀測面積[14].自1978年聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)將Uterm?hl計數(shù)法編入《浮游植物手冊》[15]以來，它在世界范圍內被接受并普遍使用，是目前國際上浮游植物調查研究最通用的方法之一.為減少濃縮時間，Paxinos等[16]曾改進Uterm?hl的靜置沉降濃縮為壓濾濃縮，其計數(shù)結果與傳統(tǒng)的Uterm?hl沉降濃縮結果具有很好的相關性(R2=0.98)；水樣中不必加入魯哥試劑進行固定，有利于被檢測的活性生物保持活性；濃縮過程只需2h左右.為縮短濃縮時間，王瓚等[17]采用濾膜過濾方法濃縮收集水體中的藻細胞，經(jīng)超聲振蕩后在顯微鏡下進行計數(shù)，與傳統(tǒng)方法的對比實驗結果表明，該方法水樣用量少、操作方便、準確快捷.膜過濾的缺點是細胞不能用明場照明，因為膜過濾法會扭曲圖像，并且很難識別不同物種和門類.因此，該方法的樣本處理速率取決于過濾的體積、樣品過濾的比例以及樣品中細胞濃度和雜質的量等[18].

由于藻類無法直接稱重，而藻類細胞形態(tài)較為規(guī)則，且細胞比重接近于1，故可用形態(tài)相似的幾何體積直接換算為生物量(濕重)[19-21]，即生物量為浮游植物的豐度乘以各自的平均體積，單位為mg/L.單細胞的生物量主要根據(jù)浮游植物個體形狀測量分析.因浮游植物體積在不同地區(qū)、不同季節(jié)都有較大變化，最好對其進行直接測量，對于數(shù)量多或體積大的種類，特別是優(yōu)勢種，更應實際測量.測量時應根據(jù)藻類體型，按最近似的幾何圖形測量其長度、寬度、直徑等，分別求得平均值，然后按求積公式計算出體積.有的種類形狀較特殊，可分解為幾部分，分別按相似幾何圖形求算相加.顯微鏡法耗時較長，對專業(yè)知識要求較高，載玻片和蓋玻片的間距使細胞呈現(xiàn)出多種形態(tài)，水樣中的非藻顆粒物也可對樣品分析造成干擾[22]，同時，顯微鏡放大倍數(shù)的局限可造成微型及超微型浮游植物的漏檢.但由于顯微鏡計數(shù)法觀測面積大、準確度高、變異系數(shù)小，能較為全面地反映樣品的種類分布情況，目前仍然為國際上浮游植物計數(shù)最通用的方法.該方法適用于濃度低、種類多的樣品[23].

血球計數(shù)法[24]雖然方便、快捷，但是如果計數(shù)室內有雜物或未洗凈的微生物時，會影響觀察和計數(shù)結果.因此，使用血球計數(shù)器之后必須將其清洗干凈.該方法適合于實驗室純種培養(yǎng)的高濃度樣品.庫爾特計數(shù)[11]是通過測量細胞體積和個數(shù)，得出各顆粒的大小，統(tǒng)計出粒度的分布，其重現(xiàn)分析功能可分析到單個脈沖信號，靈敏度較高，該方法適合于實驗室純種培養(yǎng)的樣品.

基于形態(tài)學特征對藻種進行鑒定的另一個重要研究方向就是利用計算機輔助完成的圖像分析和識別技術.目前廣泛使用的流式攝像機(flow cytometer and microscope，F(xiàn)lowCAM)綜合了顯微鏡法、葉綠素熒光法和流式細胞儀法的功能，能夠給出每一種浮游植物的尺寸和圖像；可以對浮游植物自動計數(shù)，并對其圖像進行處理，經(jīng)圖庫比對后對浮游植物進行分類測量和識別；可以根據(jù)浮游植物形態(tài)及光學特性，自動識別部分特征性浮游植物，能用于大量樣品的監(jiān)測分析；可以連續(xù)24h自動在線監(jiān)測或巡航監(jiān)測；非常適合檢測基于天然葉綠素熒光的浮游植物樣品，具有快速識別和計數(shù)的特點[25-29].FlowCAM為藻類分類鑒定提供了良好的圖像及數(shù)據(jù)，可進行種類鑒定的藻類直徑應不小于5μm，F(xiàn)lowCAM要求樣品濃度不能太低，否則儀器進樣時可能會因藻類混合不勻而導致較大的誤差[30-31].由于浮游植物種類繁多，不同種類的藻細胞可能在形態(tài)結構上具有很大的相似性，同一種類在不同生長時期或以不同視角所捕獲的照片在形態(tài)學上也可能有較大的差異，使鑒別的準確度大大降低.此外，技術上的限制可能使獲取的照片分辨率較低，增大了準確識別的難度.目前真正實現(xiàn)自動識別的系統(tǒng)并不多，可識別的物種也比較少[8-10，32].

1.2 基于色素的化學分析方法

基于色素的化學分析方法是利用浮游植物不同類群間色素組成和含量的不同來確定群落組成和豐度.其中，優(yōu)勢比較明顯的是高效液相色譜(HPLC)技術[33]，一次操作可以分離50多種色素[34].二極管陣列檢測器的使用使色素檢測更加準確、便捷[35].基于HPLC的光合色素分析技術能夠有效地進行大量的現(xiàn)場樣品分析，即使在樣品處理中存在過濾產(chǎn)生損失或處理過程導致樣品破壞的情況，但從HPLC的光合色素產(chǎn)生信號峰的差異仍然能辨析出其類群組成.在野外樣品檢測方面，原來因為顯微計數(shù)中樣品過濾或預處理所造成的種類缺失，現(xiàn)在通過HPLC色素峰也能清楚地辨別出來[36].此外，HPLC方法還使每個航次分析幾百個樣品成為可能[37].目前，該方法僅局限在綱一級水平，如果要進行種屬水平的鑒定，還需要尋找新的特征色素或色素組合[38-39].某些形態(tài)上相似的種類，可能在光合色素等生物標志物上存在差異，從而可以有效地鑒定[40].應用光合色素作為分類技術手段的缺點是尚不能完全實現(xiàn)屬和種之間的準確分類.此外，環(huán)境變化以及不同的細胞生長周期也會導致浮游植物的光合色素含量發(fā)生一些變化，從而導致分類的結果受到影響[41].所以，應用該方法對浮游植物進行定性和定量分析還很難實現(xiàn).

1.3 基于光學特性的分析方法

借助光學特性對浮游植物進行檢測的方法主要有活體熒光分析技術[42]以及基于現(xiàn)場表觀光譜和固有光譜的浮游植物檢測技術[43-45].熒光測定技術不需破碎細胞，不傷害生物體，因此通過研究葉綠素熒光來間接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法[46-49].現(xiàn)場熒光分析法主要集中于海水樣品和藍藻監(jiān)測中對光合色素的檢測[47-50].可以區(qū)分浮游植物種類的便攜式激光誘導熒光系統(tǒng)已經(jīng)研制成功[51].此外，由于不同種類浮游植物光合色素含量和組成有一定差別，因此還可以根據(jù)吸收光譜圖的差異區(qū)分不同植物類群[52].現(xiàn)場熒光檢測法的優(yōu)勢在于它可以對水下燈現(xiàn)場環(huán)境進行快速、連續(xù)、大面積測定，但不能實現(xiàn)對浮游植物的分類.借助現(xiàn)場表觀光譜和固有(反射、散射、吸收)光譜的浮游植物檢測方法[53-54]簡單且容易實現(xiàn)，但是探測精度受環(huán)境條件限制，對浮游植物的識別也比較粗糙.研究認為與藻細胞粒徑、色素結構有關的色素綜合效應是造成浮游植物比吸收系數(shù)變化的重要原因，同時也影響著浮游植物吸收系數(shù)的光譜形狀[55].因此，基于水色遙感的浮游植物總生物量反演[56-62]能實現(xiàn)對水域的大面積監(jiān)測，提供浮游植物總量信息，但不能對種類組成進行鑒定.葉綠素a濃度測定法能夠確定細胞生物量，準確度高，但操作較復雜、耗時長.不同種類浮游植物的葉綠素a相對濃度隨浮游植物群落的變化而變化，同時在不同環(huán)境條件下的葉綠素a相對濃度也有所不同[63].在純種藻培養(yǎng)中，葉綠素a與細胞濃度的比率隨細胞生理學和藻類生長階段而變化[64].因此，葉綠素a濃度只是浮游植物濃度的近似值.

1.4 基于免疫分析的檢測技術

基于免疫學分析的檢測方法已有幾十年的歷史.早期人們只是將其作為一種常規(guī)分類學手段的補充方法，能準確識別的種類也不多.近20年來，隨著科學技術的突飛猛進，基于免疫分析的檢測技術也有了長足發(fā)展.應用抗體探針的免疫測定主要有免疫熒光分析[65]、酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immune-sorbent assay, ELISA)[66]及流式細胞免疫分析[67]等.免疫分析方法無需對樣品進行預處理，設備普及度高，易實現(xiàn)商品化.但它需要制備高度專一的特異性抗體，尤其在對同一種屬進行區(qū)分的時候需要制備單克隆抗體，但是傳統(tǒng)的制備單克隆抗體的方法——雜交瘤細胞技術的費用較高且操作繁瑣，對特異性抗體的研發(fā)造成了一定的限制.目前，制備特異性強的多克隆抗體已成為可行的替代方法.目前已有關于藻類多抗制備和特異性鑒定的報道，并已成功制備出多種高特異性的多克隆抗體.將多克隆抗體技術與適當?shù)拿庖邔W檢測方法相結合可以實現(xiàn)對目標藻的定性和定量分析[68-69].

1.5 基于核酸分析的檢測技術

目前基于核酸的浮游植物定性定量分析方法主要有功能基因研究、分子指紋分析技術、分子探針技術等.功能基因的研究主要包括核糖體基因(ribosomal RNA gene, rDNA)、細胞色素b基因(Cytoclme b，cytb)、增殖細胞核抗原基因(PCNA)、Hsp90(熱休克蛋白)基因、質體rbcL(二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因)等的研究.其中，rDNA憑借其為細胞所共有、功能同源且最為古老的獨特優(yōu)點，成為目前應用最廣泛的分子指標[70-72].雖然rDNA序列分析是對浮游植物定性、定量檢測的一種較為可靠的方法，但其耗時費力，不太適合常規(guī)測定，而且，用于序列比對的美國國立生物技術研究中心數(shù)據(jù)庫(national center for biotechnology information，NCBI)里收錄的序列在研究者上傳后并未經(jīng)過嚴格的審核和驗證，其準確性無法得到保證.同時，對某一種類來說序列信息往往呈片段化，缺乏完整的rDNA基因序列信息，這就給序列比對的準確度造成了一定的影響[70-72].

基于DNA多態(tài)性的分子指紋分析技術方法簡單，重現(xiàn)性好，無需測序，在藻類的系統(tǒng)比較和分類鑒定中起著重要作用.但是，藻類基因組數(shù)據(jù)庫的不完整性限制了這些方法的應用[73].

由于分子探針技術具有專一性強、準確、快速等特點，在分子生物學研究中得到了廣泛應用[74-75].近年來，熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)技術憑借其分析速度快和靈敏性高等優(yōu)點在藻類檢測和生態(tài)學研究等領域得到廣泛應用[76].FISH的優(yōu)勢在于能準確識別出樣品中的目標生物，還能對群落結構進行研究.同時，樣品的全細胞形態(tài)為驗證探針檢測結果提供了一個重要補充.不過，該方法也存在一定缺陷，如對鏈狀形式聚生的細胞(擬菱形藻Pseudonitzschia、骨條藻Skeletonema、赤潮異彎藻Heterosigmaakashiwo等)以及在保存時容易聚集的細胞鑒定、計數(shù)較難，對裸甲藻等一些甲板不明顯微藻全細胞形態(tài)的固定和保存也有一定難度，還有其它一些因素也可能影響著熒光原位雜交的效果，如固定方法、脫色條件、低溫保存以及RNA降解等[77-78].

實時熒光PCR不僅具有普通PCR的高靈敏度，而且應用了熒光探針，既增加了檢測特異性，又可以通過光電傳導系統(tǒng)直接探測PCR過程中熒光信號的變化，因此還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性.實時熒光定量PCR技術不僅實現(xiàn)了對核酸模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點.因此，實時熒光PCR也被運用到藻類學研究中[79-80].但在浮游藻類定性定量檢測方面，該技術尚處于起步階段，其最大的限制在于很難獲得高純度的DNA樣品.

夾心雜交技術無需進行樣品純化、恒溫雜交、操作簡單.不過，該技術存在的致命缺陷是，它直接檢測極易降解的RNA，而夾心雜交中包含抗原抗體反應和許多洗滌操作，增加了RNA降解的機會，使分析結果的準確度和穩(wěn)定性不理想.此外，反應中缺少溫度控制也給特異性探針的設計帶來很大難度.為了克服夾心雜交技術的缺點，有研究者[81-82]將酶保護分析方法與夾心雜交方法相結合，采用雙特異分子探針技術并將其應用于浮游植物的檢測，但也只能對樣品中十余種藻類進行定性、定量分析.

2 淡水浮游植物計數(shù)及定量方法比較

能夠分析計算浮游植物總生物量的方法有顯微鏡法、光密度法、FlowCAM計數(shù)法、流式細胞儀法、葉綠素a法等(表1).目前很多研究者[83-88]探討了不同計數(shù)方法衡量某一種類微藻生物量的可行性，結果表明，分光光度法和熒光法是相對簡便、快捷、準確的分析方法.然而，由于不同種類微藻細胞個體大小不同，運動能力不同，而且細胞生長過程中可能存在著某些物質濃度(如葉綠素、熒光物質等)的變化，而上述研究只針對特定種類取某一生長期培養(yǎng)液進行稀釋測定，因此實驗結果適用范圍存在一定的局限性.

浮游植物計數(shù)的方法中分光光度法和庫爾特計數(shù)法操作簡單、耗時短，測定結果重現(xiàn)性好、誤差小，測定時可以不破壞樣品，特別適于連續(xù)測定，是比較簡便、快捷、有效的測定方法.但分光光度法計數(shù)細胞若采用葉綠素的最大吸收波長，其測定容易受細胞生長和生理狀態(tài)的影響，而采用濁度比色又受細胞生長后期細胞碎片和有機顆粒等非細胞因素的影響[89].FlowCAM計數(shù)法雖然準確，號稱“小流式細胞計數(shù)”，但操作比較繁瑣、耗時長，而且數(shù)據(jù)后期處理需經(jīng)過2次校正.儀器計數(shù)要求細胞條件較高，最好是處在指數(shù)生長階段中的細胞，而人為計數(shù)(如顯微鏡和FlowCAM)能分辨細胞生長后期的細胞碎片甚至死細胞.庫爾特計數(shù)采用小孔電阻原理，測量顆粒的大小和數(shù)量，統(tǒng)計出粒度的分布，其重現(xiàn)分析功能可分析到單個脈沖信號，同時分析不同類型細胞相當方便；其靈敏度較高，但線性范圍較小[90].因此，當藻密度較小時或實驗室純種培養(yǎng)、濃度高、種類單一時，采用庫爾特法效果較好；當藻密度較大時，可采用可見分光光度法[89].庫爾特計數(shù)結果一般會高于顯微鏡計數(shù)結果，因其會計數(shù)一些非細胞形態(tài)的顆粒，但校正后準確度仍然較高.在顯微鏡計數(shù)以外的計數(shù)方法中，庫爾特計數(shù)法較好，其次為分光光度計數(shù)法和FlowCAM計數(shù)法[88].庫爾特法是一種相對簡便、快捷和可靠的細胞計數(shù)方法.流式細胞儀法使單樣品操作時間較短，能靈敏檢測細胞死/活狀態(tài)，測定梯度配比的熱處理致死細胞的結果與配比值吻合良好，該方法用于紫外消毒處理水樣中的藻細胞計數(shù)及死/活狀態(tài)分析靈敏有效.顯微鏡計數(shù)法不僅能較為全面地反映樣品的種類分布情況，而且準確度高、變異系數(shù)小，目前仍然為國際上浮游植物調查研究最通用的方法.

表1 各種浮游植物計數(shù)和定量分析方法的優(yōu)缺點比較

浮游植物種類及群落結構分析對于深入研究淡水浮游植物生理特性、群落結構與功能、在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的作用等都具有重要的科學意義.目前顯微鏡計數(shù)法[91-92]、庫爾特計數(shù)法[11]、流式細胞儀法[93-94]等均可測量水體浮游植物粒徑.庫爾特計數(shù)法雖然簡單快速，可以方便地測量其粒徑分布，但不能進行種類鑒定.顯微鏡計數(shù)法是測量浮游植物粒徑的經(jīng)典方法，具有直觀、準確等優(yōu)點，并可進行種類鑒定[95].能夠鑒定浮游植物種類的藻類計數(shù)法有顯微鏡法、PCR法，而PCR法在浮游藻定性、定量檢測方面尚處于起步階段，其最大的限制在于很難獲得高純度的DNA樣品[96].

選擇適當?shù)母∮沃参镉嫈?shù)方法對浮游植物的相關研究十分重要.以上這些方法都可以用于浮游植物的計數(shù)與定量，可以根據(jù)不同的需求來選擇最佳計數(shù)方法，如樣本大小、便于分析、樣本處理率等.顯微鏡細胞定量計數(shù)法作為浮游植物定量和計數(shù)最經(jīng)典的方法，是衡量浮游植物定量、計數(shù)及其它方法是否準確的標準，在淡水生態(tài)學中具有不可替代的作用.

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A review on methods of cell enumeration and quantification of freshwater phytoplankton

QIAN Kuimei, LIU Xia & CHEN Yuwei

(StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment，NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

Phytoplankton cell enumeration made under a light microscope is a basic and classic method for freshwater phytoplankton cell counting and biomass calculation, and also a basis for testing the accuracy of other methods. With the development of technology, some methods on phytoplankton cell enumeration and biomass evaluation, such as visible spectrophotometry, fluorescence spectroscopy, flow microscope counting method, coulter cell counting method, have been developed. Comparing the characteristics of these methods, the results show that the optical density method, FlowCAM counting, flow cytometry, and chlorophyll-a determination method can only analyze phytoplankton biomass. As a classical method to measure the particle size of phytoplankton cell, phytoplankton analysis under a light microscope can analyze not only phytoplankton biomass, but also phytoplankton species and community structure. Since all the methods were generally appropriate for freshwater phytoplankton biomass analysis, ancillary considerations(e.g., easiness of analysis, sample processing rate, sample size, etc.) become critical factors for the determination of optimal phytoplankton counting method. The study indicates that cell enumeration and biomass calculation under a light microscope has an irreplaceable role in phytoplankton biomass evaluation in modern ecology.

Phytoplankton; cell enumeration; biomass, microscope； quantification

*江蘇省博士后科研資助計劃項目(1401158C)資助.2014-11-20收稿；2015-02-10收修改稿.錢奎梅(1982～)，女，博士；E-mail：qiankuimei@163.com.

J.LakeSci.(湖泊科學)， 2015， 27(5)： 767-775

DOI 10.18307/2015.0502

?2015 byJournalofLakeSciences

**通信作者；E-mail：ywchen@niglas.ac.cn.