李勝男，王秀娟，周 建，孔繁翔，史小麗**

(1：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

(2：中國科學院大學，北京 100049)

利用流式細胞儀計數(shù)微型浮游生物的方法*

李勝男1,2，王秀娟1,2，周 建1,2，孔繁翔1，史小麗1**

(1：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

(2：中國科學院大學，北京 100049)

微型浮游生物(細胞粒徑<20μm)在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起著重要的作用，對其豐度的準確測定是進一步研究微型浮游生物在不同水生生態(tài)系統(tǒng)中作用的重要基礎.相對于傳統(tǒng)的顯微鏡檢測技術，流式細胞術不僅具有分析速度快、靈敏度和準確度高等優(yōu)點，而且可以同時測量單個細胞的多個生理參數(shù).不同類型微型浮游生物流式細胞術的應用原理是不同的.對于自養(yǎng)型浮游藻類，主要根據(jù)藻體內色素的自發(fā)熒光對其進行分辨和計數(shù)；而對于異養(yǎng)型細菌、原生動物及浮游病毒等，還需借助外源熒光染料對細胞核酸染色后再進行分析.目前流式細胞術已成為浮游藻類和異養(yǎng)細菌豐度檢測的常規(guī)方法，但是，由于原生動物具有更大的細胞體積且在自然水體中豐度較低；而浮游病毒粒徑又太小，甚至低于光源激發(fā)波長，因此流式細胞術應用一直受到限制，直到近10年來才有相關報道.本文對運用流式細胞術計數(shù)浮游藻類、浮游細菌、原生動物和浮游病毒的具體原理、方法和進展進行綜述，并對流式細胞儀在未來水生微生物學領域的應用進行展望.

流式細胞儀；浮游植物；異養(yǎng)細菌；原生動物；病毒；色素；熒光染料

微型浮游生物(細胞粒徑<20μm)主要包括浮游藻類、異養(yǎng)細菌、原生動物和浮游病毒等，是微食物環(huán)的主要組成部分，在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用[1]，因而對這些微型浮游生物的準確計數(shù)就顯得尤為重要.定量檢測其種群動態(tài)變化，不僅有利于研究其種間營養(yǎng)關系，更有助于探索這些微生物在生物化學地球循環(huán)中所起的重要作用.傳統(tǒng)顯微計數(shù)方法的優(yōu)勢在于可通過形態(tài)特征觀察，對不同類型的微生物分別計數(shù)，但是，這種計數(shù)方法不僅費時費力，而且需要豐富的種類鑒定經(jīng)驗，人為誤差較大；此外，在實際研究中由于微生物數(shù)量變化迅速，通常采樣頻率高，樣品量巨大，僅通過顯微鏡計數(shù)難以滿足研究需求.而且在很多研究中常常不需要對這些微生物進行具體的分類計數(shù)，只需測定其類群總量.流式細胞儀(flow cytometry)的應用，使得這些問題迎刃而解.

流式細胞技術是指對處在快速直線流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術.樣品中的懸浮顆粒(如微型浮游生物細胞)在鞘液的包被下呈單行排列，依次流經(jīng)檢測區(qū)域.在檢測區(qū)，激光束照射在通過的顆粒上，一方面由于顆粒大小和內部結構等的差異向四周發(fā)射不同角度的散射光；另一方面顆粒吸收光能激發(fā)不同波長或顏色的熒光，而這些散射光和熒光都能被不同的檢測器檢測產生信號.散射光主要分為前向角散射光(forward scatter light, FSC)和側向角散射光(side scatter light, SSC)，F(xiàn)SC與被測顆粒的直徑密切相關，基本上可表征顆粒的大小；而SSC受顆粒的內部結構如細胞質折射率、細胞器等影響重大，反映的是細胞的復雜程度.發(fā)射熒光經(jīng)一系列雙色反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號，這些熒光信號的強弱代表了細胞顆粒內含有相關熒光物質的濃度，如浮游植物細胞中所含能自發(fā)熒光色素的濃度.通過這些表征顆粒不同性質的光信號就可將不同類型的顆粒區(qū)分開來.相對于顯微計數(shù)，流式細胞術可以同時對多種不同大小、不同熒光特性的細胞進行計數(shù)，不僅準確性高，而且能測得更多的參數(shù).此外，流式細胞術還具有分析速度快、精確度高、樣品預處理更簡單等優(yōu)點.

流式細胞儀主要以單細胞懸浮液(球形顆粒最佳)為研究對象，因此起初主要應用于哺乳動物細胞的常規(guī)檢測，直到1970s末、1980s初，流式細胞儀才開始應用于水體浮游顆粒研究[2-3]，并迅速成為微型浮游生物尤其是超微型浮游生物快速、準確的分析工具，極大地促進了水生生態(tài)學的發(fā)展，尤其在海洋水體應用廣泛[4-7].而且，正是由于流式細胞儀的應用，才導致了一些特定種群的發(fā)現(xiàn)，如原綠球藻和最小的超微真核藻Ostreococcus等[8-9].事實上，在流式細胞計數(shù)應用于海洋浮游生物研究之前的很長一段時間內都是將原綠球藻誤認為是細菌而過高估計了細菌生物量.目前國外已有一些關于流式細胞儀的文獻綜述，對其原理、研究進展等進行了詳細介紹[3,6,10-12]，但是還沒有專門針對微型浮游生物，尤其是剛起步的原生動物及浮游病毒的流式細胞儀應用綜述.本文針對不同類群的微型浮游生物，詳細介紹了流式細胞計數(shù)的具體應用原理、方法及其進展，旨在為水生生態(tài)學研究者們起到指導性作用.

1 浮游藻類計數(shù)

表1 主要光合色素的光學特征

浮游藻類細胞由于含有各種類型能夠自發(fā)熒光的光合色素，如葉綠素a，因而特別適用于流式細胞檢測，而且根據(jù)葉綠素a紅色熒光的存在與否，可直接將浮游藻類與其他無機顆粒或異養(yǎng)細胞區(qū)分開來.不同種類浮游藻類功能色素組成的不同主要表現(xiàn)在激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的差異上(表1)[10].由于光源限制，一般利用發(fā)射光譜區(qū)分不同類型藻類.目前流式細胞儀中多采用488nm藍光激光源，根據(jù)研究需要還可額外定制添加光源(如紫外激發(fā)光源).一般在浮游藻類發(fā)射光譜中主要為葉綠素a、藻紅素和藻藍素3種類型的熒光，熒光素較少，而類胡蘿卜素和其他微量色素則可能由于光合作用的能量轉換而沒有被觀察到[10].因此，在水體中葉綠素a、藻紅素和藻藍素是主要熒光來源.

事實上，從1980s流式細胞術應用于浮游藻類檢測以來，主要都是根據(jù)細胞大小及色素差異對一些特定類群藻類進行識別[13-14].Trask等對8種分屬于5綱的不同純培養(yǎng)藻類用流式細胞儀進行研究，發(fā)現(xiàn)不同類型藻類由于大小和色素含量的不同，其FSC、SSC及葉綠素a自發(fā)紅色熒光的強度是不同的，但由于存在著大量的峰重疊區(qū)域，僅用一種參數(shù)難以準確區(qū)分各種類群的藻；盡管如此，當將各參數(shù)結合起來時(如FSC vs SSC或SSC vs葉綠素a等)則能很好地區(qū)分不同種類的藻，因為他們在二維圖上的位置不同，而參數(shù)的選擇則取決于藻的種類[2].但是野外樣品要比室內純培養(yǎng)藻樣復雜的多，對于室內純培養(yǎng)樣品，根據(jù)其在流式二維或三維圖上的位置就可確定藻種類型，而野外樣品藻的差異要大得多，分布在流式圖同一區(qū)域的細胞可能是多種具有相同性質藻類的混合體，尤其是大多數(shù)都為含有葉綠素a的真核藻類細胞[14].但若某一類群藻類含有特異性的光合色素或特殊結構時，就可據(jù)此與其他類型藻類區(qū)分開來，例如聚球藻(Synechococcus)、原綠球藻(Prochlorophytes)、具有鈣質外殼的球石藻(Coccolithophorids)、殼縫羽紋硅藻(pennate diatoms)和一些含藻紅素的隱藻(Cryptophytes)等[14-16].因此，在研究野外樣品時，根據(jù)散射光和熒光信號，流式細胞儀一般只能將細胞區(qū)分為幾個主要的光學性質相似的功能群，如細胞粒徑較大、葉綠素a含量豐富的真核藻細胞和細胞粒徑較小、藻藍素或藻紅素含量豐富的原核藍藻細胞[17-20].

盡管如此，由于水體中較大粒徑的浮游藻類濃度普遍較低，在相同的時間內通過檢測區(qū)域的細胞數(shù)量少，有的甚至低于流式細胞儀的檢測限，并且光譜特性同一性強，基本都因含葉綠素a而發(fā)射紅色熒光[14,21]，而這些藻類在普通光學顯微鏡下也容易辨認，因而其流式細胞應用受到限制.相反，相對于大型藻類，超微型浮游植物由于細胞濃度高，足以達到流式細胞儀的檢測范圍，而且由于細胞體積小，形態(tài)特征不明顯，普通顯微觀察難以辨認，故更適合于流式細胞分析，而目前流式細胞儀應用于浮游藻類研究也主要是針對超微藻[5,17-18].

雖然流式細胞儀功能強大，優(yōu)勢明顯，但是由于價格昂貴，且屬精密儀器，一般的研究調查很難滿足隨船攜帶的條件，無法對新鮮樣品進行現(xiàn)場測定，需要將樣品固定后用液氮速凍保存，帶回實驗室分析.一般常用的固定劑如魯哥試劑、福爾馬林(含甲醇)、乙醇等會對藻類色素熒光產生顯著影響，因此不適用于流式分析[22].目前一般使用醛類固定劑如戊二醛、甲醛和多聚甲醛等[23-25]用于流式細胞分析的樣品保存，但是由于市售的甲醛一般都含有甲醇，而多聚甲醛不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用最好，所以選用戊二醛為固定劑最方便實用[26].Marie等通過添加表面活性劑Pluronic F68優(yōu)化了常規(guī)的固定方法，可更好地減少固定引起的細胞(尤其是真核細胞)損失[26].

2 浮游細菌計數(shù)

1980s流式細胞技術引入水生生態(tài)學領域初期，由于浮游藻類所含光合色素是天然的熒光標記，因此大多研究都主要集中于浮游藻類的研究，如水體中兩種主要的原核自養(yǎng)生物聚球藻和原綠球藻因含有不同的光合色素，利用流式細胞儀很容易區(qū)分.但是，分布在同一粒徑范圍內的異養(yǎng)細菌，由于缺少易被識別的光合色素，流式細胞儀的應用受到阻礙，發(fā)展也相對緩慢.而實際上，自然水體中異養(yǎng)細菌含量豐富，濃度可達106cells/ml的數(shù)量級，非常適合流式細胞檢測.傳統(tǒng)的細菌計數(shù)利用熒光染料如DAPI對其DNA進行染色，然后用熒光顯微鏡觀察計數(shù)，這種染色法同樣適用于流式細胞儀.至20世紀初，流式細胞儀已經(jīng)發(fā)展成為計數(shù)自養(yǎng)和異養(yǎng)細菌的標準方法.Robertson等通過DAPI染色，根據(jù)水體中細菌的種群豐度、大小和DNA含量等特性，首次利用流式細胞儀對自然水體中浮游細菌進行計數(shù)，并給出了詳細的染色方法和操作準則[27].隨后，Monger等采用了另一種比DAPI背景熒光和CV值低且計數(shù)準確性更高的紫外激發(fā)熒光染料Hoechst 33342用于計數(shù)細菌[28].盡管通過DAPI或Hoechst 33342染色后利用流式細胞儀計數(shù)的結果與熒光顯微計數(shù)的結果具有很好的一致性，但是由于一些超微型光合自養(yǎng)原核細胞(如原綠球藻)與異養(yǎng)細菌的粒徑大小和DAPI/Hoechst 33342-DNA藍色熒光都具有很大的重疊區(qū)，而且用于區(qū)分異養(yǎng)細菌的原綠球藻葉綠素紅色熒光在紫外光激發(fā)下非常微弱，并且持續(xù)時間短，無論是熒光顯微鏡還是流式細胞儀都難以辨別，所以很難將二者區(qū)分開來.只有通過添加第二個488nm激發(fā)光源，更好地激發(fā)葉綠素紅色熒光，才能將自異養(yǎng)細胞區(qū)分開來，從而準確地計數(shù)異養(yǎng)細菌[28].

熒光染料的選擇一般取決于儀器可用的激發(fā)光源及樣品類型.采用紫外激發(fā)的熒光染料需要流式細胞儀配置紫外激發(fā)光源，因而應用受到限制.而目前市售的流式細胞儀普遍采用488nm藍光激發(fā)光源，因此促進了大量藍光激發(fā)核酸染料的應用(表2)，這樣只用一根激光就可區(qū)分自養(yǎng)和異養(yǎng)細菌.由于PI和EB染料發(fā)射的紅色熒光會對葉綠素熒光產生干擾，因而不適用于自然水體原核生物的流式分析.采用YOYO-1、YO-PRO-1和PicoGreen等核酸染料雖然能取得較好的結果，但是由于他們對離子的高敏感性，而且需要輔助因子如鉀、檸檬酸鹽和EDTA等的作用，不適用于自然水體樣品[29].還有一些染料如TOTO-1和TO-PRO-1等由于不滲透膜，必須使用表面活性劑(如Triton X-100)使其穿透細胞，但是Triton X-100的使用會同時導致葉綠素的損失，從而無法區(qū)分異養(yǎng)細菌和原綠球藻[30].Lebaron等對包括SYTO-9、SYTO-11、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-BC、SYBR Green Ⅰ和SYBR Green Ⅱ在內的7種藍光激發(fā)的核酸染料進行比較研究，這些染料都可以用于完整的活細胞，無需固定，相反，固定引起的細胞收縮會導致散射光測量偏差，并且會降低SYTO類型染料的激發(fā)熒光[31]；此外，對于不同類型的水體，不同染料的熒光強度差異巨大：對于淡水水樣，SYTO-9、SYTO-16、SYBR GreenⅠ和SYBR GreenⅡ的熒光強度更高，而SYTO-13、SYTO-11的熒光強度較低，SYTO-9的熒光強度最高，但其屬于試劑盒產品，一般不單獨銷售；相反，對于海洋水樣，SYBR GreenⅠ和SYBR GreenⅡ具有更高的熒光強度[31].目前，SYTO-13和SYBR GreenⅠ是最適用于自然水體浮游細菌計數(shù)的熒光染料，其使用率也最高[32-36]，尤其是SYTO-13.值得注意的是，不同的染料具體的染色濃度和染色時間等也不同，已有很多研究者們對此作了詳細驗證(表2)，可為后來研究者提供參考.

表2 已用于流式分析水體浮游細菌的核酸熒光染料

利用流式細胞儀不僅可以快速、準確地對細菌總數(shù)進行計數(shù)，而且可根據(jù)細胞相對大小和核酸含量將細菌分成幾個主要的亞類群，分別進行計數(shù).對自然水體細菌的流式分析發(fā)現(xiàn)，在流式散射光vs綠色熒光二維圖上可以明顯區(qū)分出兩種不同大小和核酸含量的細菌，即低DNA含量(LNA)和高DNA含量(HNA)的細菌[30,35-36,42].Garcia等甚至提出了一種基于模型的聚類技術，無需人工設門，就可以自動將保存在流式文件中的LNA和HNA細菌區(qū)分開來，大大簡化了后期的數(shù)據(jù)處理過程[43].細菌核酸含量的差異可由多種原因引起，如DNA復制、細胞分裂、營養(yǎng)物質濃度等；不同種類細菌也可能具有不同的DNA含量[30].因而這些不同核酸含量的細菌亞類群可能具有重要的生態(tài)意義.Li等認為高DNA含量的細菌具有更高的生長勢，在浮游植物豐富的水體占優(yōu)勢，反之低DNA含量的細菌在浮游植物貧乏的水體占優(yōu)勢，因此細菌受浮游植物影響重大[30].Lebaron等則發(fā)現(xiàn)細菌總生產力主要都是來自HNA細菌，相對于細菌豐度，細菌核酸含量更能表征細菌的生長[36].此外，結合其他分子特異性熒光探針，可更具體地針對不同種類的細菌進行計數(shù)，而且還可以利用染料的膜通透性對細胞進行活性檢測[36,44-45].

3 原生動物計數(shù)

相對于藻類和細菌，原生動物的流式應用要復雜的多.首先，由于原生動物中沒有可被流式細胞儀識別的特征光合色素，如葉綠素、藻藍素等，因而很難將其與其他顆粒區(qū)分開來；其次，水體中細菌等引起的背景濃度過高，難以有效區(qū)分原生動物細胞信號；第三，相對于細菌、病毒等超微型細胞顆粒，原生動物粒徑較大，在水體中的豐度相對較低，幾乎達到流式細胞儀的檢測下限，而流式細胞儀所測樣品體積相對較小，原生動物一般很難被檢測到.所以流式細胞儀應用于原生動物計數(shù)一直受到限制.直到近10年來，才開始有一些研究報道原生動物的流式檢測，而國內目前還沒有相關報道.Zubkov等在研究鞭毛蟲對不同細菌的捕食效率時，通過SYBR Green Ⅰ染色，利用流式細胞儀測定了鞭毛蟲的數(shù)量變化[46].隨后，Lindstr?m等建立了一套利用流式細胞儀分析粒徑更大的純培養(yǎng)的纖毛蟲等原生動物捕食速率的方法，并與顯微計數(shù)結果進行了比較，獲得了較好的一致性.但是，流式技術應用的前提是捕食者與被捕食者的細胞粒徑相差很大，而且雜質含量低，否則也很難將他們區(qū)分開來；同時他們也比較了3種可被488nm藍光激發(fā)的熒光染料TO-PRO-1、YOYO-1和PicoGreen的流式應用效果，并發(fā)現(xiàn)TO-PRO-1應用效果最好[47].

由于野外樣品極其復雜，所含雜質多，因此目前有關流式細胞儀應用于原生動物的檢測多為純培養(yǎng)樣品，而很少應用于自然水體.此外，原生動物最終產生的熒光信號要遠遠大于細菌產生的信號(35倍以上)，從而使原生動物信號位于象限外[48]，因此也不能將流式計數(shù)異養(yǎng)細菌的方法直接應用于原生動物計數(shù).Rifà等通過提高熒光信號的閾值并降低檢測電壓的方法，使低熒光信號的顆粒如細菌等低于檢測限，而只有較高熒光信號的顆粒(多為異養(yǎng)鞭毛蟲)被檢測到，但此應用的主要限制條件就是水體中細菌與鞭毛蟲的比例不能高于1000，否則，高核酸含量細菌所產生的背景值過高，仍會導致難以區(qū)分出異養(yǎng)原生動物[48].而實際野外水體中細菌與鞭毛蟲的比例常常超過1000，因此應用受到限制.Rose等采用一種新的熒光染料LysoTracker Green，它對酸性細胞器如真核細胞中的營養(yǎng)液泡、溶酶體及葉綠體等具有親和性，而原核細胞不具有這些細胞器，從而將真核和原核細胞區(qū)分開來.再通過自養(yǎng)細胞光合色素的自發(fā)熒光信號，就可將自養(yǎng)和異養(yǎng)真核細胞區(qū)分開來，從而鑒別出異養(yǎng)原生動物[49].但是這種染料只能用于活細胞，因為固定會破壞細胞膜的勢能，導致熒光丟失.當樣品量較少時可采用這種方法，但是當樣品量很多時，該方法的應用會受到限制，因為若不固定，鞭毛蟲等原生動物的豐度在幾個小時內就會發(fā)生變化，從而給測定結果造成影響[50].因此，應根據(jù)樣品類型和研究目的選取合適的染料和檢測方法.

另一方面，自然水體中原生動物豐度很低，如異養(yǎng)鞭毛蟲的豐度通常只有102～103cells/ml，幾乎達到流式細胞儀的最低檢測限，雖然可通過富集濃縮的方法解決此問題，但是由于原生動物細胞極其脆弱，此方法很可能造成巨大的細胞損失.Zubkov等通過利用一種注射泵(syringe pumps)上樣，大大提高了流式細胞儀的分析流速，可超過1.0ml/min，這樣在相同的時間內，可分析更大體積的樣品，從而使更多的原生動物細胞能夠被檢測到，完美地解決了原生動物豐度過低的問題[51-52].但是可能由于需要安裝使用額外的泵，此方法并沒有得到廣泛應用[50].Christaki等利用SYBR Green Ⅰ染色，結合前人的分析方法，通過延長檢測時間、增加熒光信號的閾值并降低檢測電壓，同時對不同實驗條件(固定劑種類、染色劑濃度、染色時間及流式細胞儀設置等)進行綜合比較、驗證和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)無需注射泵，直接將流速提高到120～220μl/min，同時增加檢測時間(8～10min)，就可以檢測到10-2cells/ml數(shù)量級豐度的鞭毛蟲.此外，研究還指出，戊二醛固定效果最好，然后液氮速凍，-80℃保存最佳；解凍后，利用SYBR Green Ⅰ染色，終濃度為1∶10000，最佳染色時間不短于10min，而且無需添加檸檬酸鉀等就能達到很好的染色效果.他們提出的這一套異養(yǎng)鞭毛蟲流式計數(shù)方法更為方便簡單，相信會得到廣泛應用[50].

4 浮游病毒計數(shù)

由于病毒顆粒太小，Porter等指出幾乎不可能利用傳統(tǒng)的流式細胞儀進行檢測[53].但是，隨著一些高性能綠色熒光核酸染料如SYBR Green Ⅰ、SYTO 13和TO-PRO-1等的應用，流式細胞儀應用于浮游病毒的檢測也成為可能.這些熒光染料在488nm激光激發(fā)下具有更高的量子產率，可發(fā)射更強的綠色熒光，大大提高了流式細胞儀的檢測限.Marie等通過SYBR Green Ⅰ染色首次利用標準流式細胞儀成功地檢測和計數(shù)了海洋中的浮游病毒，并且與透射電鏡和熒光顯微鏡的計數(shù)結果具有很高的相關性[54].Brussaard等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不同形態(tài)特征和基因大小的病毒都可利用流式細胞儀進行檢測[55].結合SYBR Green Ⅰ染色，流式細胞儀不僅可用于室內純培養(yǎng)病毒樣品檢測[56-57]，而且還被成功地應用于自然環(huán)境樣品檢測[58-62].

影響流式細胞儀病毒檢測的因素有很多，例如固定、保存的方法，稀釋液的類型，染料的種類和濃度以及孵育溫度等[54].研究發(fā)現(xiàn)，戊二醛固定效果比多聚甲醛更加穩(wěn)定[55]，在0.1%～1.0%范圍內不同濃度戊二醛固定對病毒計數(shù)結果并無顯著影響[54].但是無論是多聚甲醛還是戊二醛，固定后若僅保存于4℃，隨時間推移，病毒濃度均逐漸減少，這可能是由于聚集物形成或核酸酶對病毒的降解所致，所以應液氮速凍后，-80℃低溫保存[54].其次，由于浮游病毒是水體中數(shù)量最大的生命顆粒，可達1010L-1，是細菌的5～25倍，為防止流式分析時巧合事件(由于樣品濃度過高，常常兩個或多個顆粒同時通過檢測區(qū)域，而儀器只能將多個顆粒記為一個事件，從而低估樣品濃度，稱為巧合事件)的發(fā)生，必須將樣品稀釋后再進行分析.Marie等利用培養(yǎng)基、0.2μm過濾的海水和TE緩沖液3種溶液分別對樣品進行稀釋，發(fā)現(xiàn)利用TE緩沖液稀釋效果最好，培養(yǎng)基和0.2μm過濾的海水稀釋要比用TE緩沖液稀釋后的檢測結果低5～6倍，而且用培養(yǎng)基稀釋所產生的背景值更高[54].染料的種類和濃度對計數(shù)結果也有較大影響.Chen等利用流式細胞儀對聚球藻病毒進行檢測，發(fā)現(xiàn)SYBR Gold比SYBR Green Ⅰ染色效果更好[59].而Brussaard等對SYBR Green Ⅰ、SYBR Green Ⅱ、OliGreen和PicoGreen 4種染料進行比較，發(fā)現(xiàn)SYBR Green Ⅰ效果最好，產生的綠色熒光最強[55]，它也是目前使用最多的染料.此外，由于病毒核酸被衣殼包被，不能立即與SYBR-I或其他核酸染料結合，從而使檢測結果被低估，通過加熱或添加表面活性劑如Triton X-100可使病毒衣殼變性，使染料穿透[54].所以通常分析前，將樣品加熱到80℃可顯著增強染色效果[63].由于影響因素眾多，不同研究者們所采用的方法常常不同.Brussaard等通過對不同實驗條件進行比較，總結了流式細胞儀計數(shù)病毒的最佳條件，即：0.5%終濃度的戊二醛于4℃固定5～30min，液氮速凍后-80℃低溫保存；利用TE緩沖液(pH=8)稀釋，SYBR Green Ⅰ染色，染料終濃度為5×10-5，然后暗處80℃孵育10min，最后冷卻5min，就可上樣進行流式分析[63].

病毒粒徑只有幾十到幾百納米，多數(shù)都小于激發(fā)光波長，因此SSC并不能表征顆粒的大小和粒度，而且研究還發(fā)現(xiàn)染色后綠色熒光強度與病毒基因大小也并無顯著線性相關關系[55].盡管如此，SSC和綠色熒光信號強度對于不同病毒類型的區(qū)分仍非常有用.根據(jù)綠色熒光信號的強度，流式細胞儀可至少區(qū)分出自然水體中兩個不同類群的浮游病毒：Ⅴ-Ⅰ型和Ⅴ-Ⅱ型.Ⅴ-Ⅰ型病毒綠色熒光最強，粒徑更大；而Ⅴ-Ⅱ型病毒能全部通過0.2μm孔徑濾膜，粒徑相對較小；在數(shù)量上，Ⅴ-Ⅱ型病毒是Ⅴ-Ⅰ型病毒的4～10倍，與自養(yǎng)和異養(yǎng)細胞的比例相當，表明Ⅴ-Ⅰ型病毒很可能是浮游植物(尤其是真核細胞)病毒，而Ⅴ-Ⅱ型病毒則可能是豐度更高的異養(yǎng)細菌病毒[54].

5 應用展望

目前流式細胞儀在微型浮游生物方面的應用仍以計數(shù)為主.但其在微生物生態(tài)學領域的應用遠不止于此，可以說其應用具有相當?shù)撵`活性，只要顆粒能夠發(fā)射熒光或通過某種方法使其發(fā)射熒光就能被流式細胞儀檢測.除了對這些微型浮游生物進行常規(guī)的檢測計數(shù)外，流式細胞儀還可以測定微生物中DNA和RNA的含量，并且能進行細胞周期分析[64]；結合分子特異性熒光探針，進行原位雜交，利用流式細胞儀可對具體到屬種水平的不同微生物類群進行分析[44,65-66].

此外，流式細胞儀最強大也是其特有的功能在于分選，它能夠將其檢測出來的細胞亞類群分選出來，供進一步深入研究，如利用流式細胞儀分選出來的細胞進行純培養(yǎng)[67]，還可以結合分子生物學技術，進行系統(tǒng)進化分析[19].甚至可以將單個細胞分選出來進行分析[68]，這必然也會成為一種新的研究趨勢.

值得注意的是，利用流式細胞儀區(qū)分出來的細胞類群大都并不是系統(tǒng)進化階元上的某一具體的分類類群，它們只是通過細胞光學性質區(qū)分出的具有相似性質(如大小、色素含量等)的某一生態(tài)功能群，如富含葉綠素的超微真核藻、藻藍素細胞、藻紅素細胞以及LNA和HNA等，這既是流式細胞儀應用的一大限制，也是一種優(yōu)勢.因為這些細胞類群也具有重要的生態(tài)意義，甚至有學者提出了“流式細胞多樣性”的概念，用以表征某自然水體中流式細胞儀分辨出細胞類群的多樣性[30].已有研究表明，葉綠素a和初級生產力較高的水體中流式細胞多樣性和均勻度更高[69].Schiaffino等發(fā)現(xiàn)水體營養(yǎng)狀態(tài)對超微型浮游生物的流式細胞多樣性影響重大，藻紅素細胞在寡營養(yǎng)和透明度較高的水體中更占優(yōu)勢，而隨著葉綠素濃度的升高，藻藍素細胞和超微真核藻取代藻紅素細胞成為競爭優(yōu)勢種；更重要的是，利用流式細胞儀與變性梯度凝膠電泳(DGGE)獲得了相同的多樣性結果[70].相信對“流式細胞多樣性”的記錄及其分析研究可進一步促進流式細胞儀的應用.另一方面，也可通過流式細胞儀的分選功能，將其區(qū)分出來的細胞類型分選出來，再結合熒光顯微鏡進行種屬鑒定或通過分子生物學技術進行系統(tǒng)發(fā)育分析，同時建立數(shù)據(jù)庫，這樣在日后的研究中就可利用已建立的數(shù)據(jù)庫對野外樣品進行具體的分類計數(shù).此外，近年來新開發(fā)的流式影像術(FlowCAM)通過結合流式細胞術和顯微鏡技術，不僅實現(xiàn)了浮游生物的自動分類，更顯著提高了樣品的分析效率[71]；結合光片照明顯微技術，甚至可以獲得3D圖像，大大提高了分辨率和精確度[72].

傳統(tǒng)的流式細胞儀更加適用于分析較小的細胞(<15μm)，而對于體積較大的浮游生物細胞例如原生動物等的應用常常受到限制，而且由于湖泊、河流等淡水樣品所含雜質較多、背景復雜，為防止堵塞流式細胞儀噴嘴，通常還需要經(jīng)過預過濾處理，非常不利于傳統(tǒng)流式細胞儀的應用.但是，隨著技術的發(fā)展，一些功能更加強大的新型流式細胞儀不斷被開發(fā)出來，為浮游生物的監(jiān)測提供了新的手段.例如便攜式浮游植物分析流式細胞儀(CytoSense)、在線監(jiān)測型流式細胞儀(Cytobouy)和可在水下使用的自動流式細胞儀(FlowCytobot)等，他們實現(xiàn)了對微型浮游生物進行連續(xù)定量、實時原位的監(jiān)測[73-75].相信技術的革新及與其他技術的聯(lián)用將會使流式細胞術越來越廣泛地應用于水體浮游生物檢測方面的研究.

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Application of flow cytometry to enumerate small plankton

LI Shengnan1,2, WANG Xiujuan1,2, ZHOU Jian1,2, KONG Fanxiang1& SHI Xiaoli1

(1:StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

(2:UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,P.R.China)

The small plankton(cell size less than 20μm) plays an important role in the circulation of materials and energy flow of the aquatic system. Accurate enumeration of these organisms is the basis for understanding their ecological role in various water bodies. In comparison with microscopy observation, flow cytometry analysis is much more advantageous in terms of speed, sensitivity and accuracy. Moreover, multiple parameters of a single cell could be measured simultaneously using flow cytometry. The protocol to enumerate plankton depends on the type of plankton. Discrimination of several major groups of phytoplankton is mainly based on the differences in the fluorescence properties of their photosynthetic pigments. While for the heterotrophic bacteria, protozoan and viruses, a combination of exogenous fluorochromes staining on cell components(mainly nucleic acids) is required to better characterize different cell groups. Now flow cytometry has become a routine methodology for detecting density of the autotrophic phytoplankton and heterotrophic bacterioplankton. However, it has been only used in quantification of protozoan and viruses in the recent 10 years, for those applications which are much more difficult and complicated for the larger cell size and less abundant densities of protozoan and much smaller cell size(even smaller than the wavelength of the laser light used) of viruses compared to bacterioplankton and small phytoplankton. The different principles and protocols used to discriminate autotrophic phytoplankton, heterotrophic bacteria, protozoan and viruses through flow cytometry were reviewed in detail, and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology were also prospected.

Flow cytometry; phytoplankton; heterotrophic bacteria; protozoan; viruses; pigments; fluorochromes

*國家自然科學基金項目(31270507，31070420)資助.2014-12-28收稿；2015-02-04收修改稿.李勝男(1989～)，女，博士研究生；E-mail：shengnan1989812@126.com.

J.LakeSci.(湖泊科學)， 2015， 27(5)： 757-766

DOI 10.18307/2015.0501

?2015 byJournalofLakeSciences

**通信作者；E-mail：xlshi@niglas.ac.cn.