薛杉吳鋼羅詩雨張鵬張洪鈿法志強郭燕舞柯以銓徐如祥

·基礎研究·

嚙齒動物上皮祖細胞與生物材料水凝膠生物相容性的體外研究

薛杉1吳鋼2羅詩雨3張鵬4張洪鈿4法志強1郭燕舞1柯以銓1徐如祥4

目的體外檢測培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠材料的相互影響，為體外培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠共移植治療提供理論依據(jù)。方法選擇兩款不同組分的水凝膠Matrigel和PuraMatrix作為實驗材料，以EPCs作為檢測細胞，將EPCs培養(yǎng)于不同濃度的Matrigel(10%、20%、30%)或PuraMatrix(0.25%、0.5%、1%)表面，或與不同濃度的Matrigel或PuraMatrix混懸培養(yǎng)，于培養(yǎng)的不同時間觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)，并用Alamar Blue法檢測細胞的增殖情況，以確定材料的細胞毒性。觀察EPCs在水凝膠中的成管化狀態(tài)，以檢測細胞是否仍具有生理功能。結果三種濃度Matrigel中30%的Matrigel細胞毒性較大，而三種濃度的PuraMatrix中1%的PuraMatrix細胞毒性較大。EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強。EPCs在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，在10%的Matrigel表面和混懸其中培養(yǎng)7 d，多數(shù)細胞沉底。20%的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化。而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化。PuraMatrix在0.25%和0.5%的濃度時，EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面與細胞混懸其中的細胞增殖率相比無明顯差異；而在1%時EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面和混懸其中存活率均很低。EPCs在0.25%和0.5%的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細胞能夠穿入PuraMatrix中。而在0.25%的PuraMatrix中培養(yǎng)細胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix中培養(yǎng)7 d能夠成管化。三種細胞密度相比，107個/ml的細胞密度EPCs更容易體外成管化。結論Matrigel和PuraMatrix在適當?shù)臐舛?20%Matrigel和0.5%PuraMatrix)均能與培養(yǎng)細胞良好的相容，并且起到支撐作用，模擬正常生理狀態(tài)，給細胞提供一個三維生長環(huán)境。由于PuraMatrix為人工合成肽產物，降解產物無毒性，可能是更適合移植的生物材料。

內皮祖細胞； 水凝膠； 生物相容性

中樞神經損傷后往往形成一個空腔，而神經再生時需要細胞替代和分化，但空腔中沒有任何結構可供細胞附著。因此，使用適當?shù)纳锊牧辖Y合干細胞移植是潛在的治療中樞神經損傷后神經再生的方式。理想的生物材料應具有無生物毒性，可生物降解，為組織重建提供一個三維立體支架，孔徑可供組織重建時血管化，誘發(fā)最小的免疫反應的特性[1]。已有應用嚙齒動物干細胞結合生物材料支架應用于細胞治療神經創(chuàng)傷的動物實驗[2-4]。但尚沒有水凝膠材料的應用實驗，水凝膠具有可被注入脊髓或腦損傷空腔，然后原地聚合，適應損傷空腔形狀的優(yōu)點。本實驗檢測體外誘導的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)與基質膠(Matrigel)和自組裝蛋白肽水凝膠 (PuraMatrix)(均為美國BD公司產品)兩種水凝膠材料之間的相容性?；|膠Matrigel是Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤細胞基底膜提取物。它的成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、內功素、巢蛋白、肝素化硫酸鹽蛋白多糖以及一些生長因子[5]。低溫時為液態(tài)，但溫度升高至室溫即可形成凝膠[6]。GFR-Matrigel是無生長因子除TGF-beta 的Matrigel。自組裝蛋白肽水凝膠PuraMatrix是一種肽合成的水凝膠，是在酵母菌蛋白中發(fā)現(xiàn)的與EAK16重復串聯(lián)相似的離子自組裝寡肽。這是一個16-mer肽按照精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸(RADARADARADARADA或RAD16)的序列重復構成的，可容納超過99%含量的水。當暴露于單價陽離子時β-sheet結構自發(fā)的聚合起來而使水凝膠自溶解狀態(tài)凝膠化[7]。已經有實驗證明這種凝膠可以支持細胞增殖和附著[7]。尚沒有實驗檢測這些水凝膠和脂肪來源EPCs的生物相容性，EPCs是一種具有自我增殖分化能力，并主要參與血管新生的細胞，適合用于細胞移植術的細胞來源。理想的生物材料應具備的性質之一就是孔徑可供組織重建時血管化，為此本實驗體外觀察EPCs在水凝膠中是否能夠成管化，為進一步動物實驗做準備。

材料和方法

一、實驗動物

大鼠的脂肪干細胞 (adipase derived stem cells，ADSCs)分離自近交系雄性Wistar大鼠(2月齡，體質量220~280 g)腹股溝脂肪墊。具體分離培養(yǎng)ADSCs并進一步誘導為骨髓源性EPCs和脊髓源性神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的方法詳見本實驗室前期工作[8]。

二、實驗試劑材料

本實驗選擇的基質膠為去生長因子的Matrigel(Becton，Dickinson and Company.Bedford，MA，USA)，以期將非基質膠對EPCs的影響降到最低。另一種水凝膠為PuraMatrix(Cambridge，MA，USA)。

三、實驗分組

本實驗分別設Matrigel表面組 (EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面)、Matrigel內部組 (EPCs于Matrigel內部立體培養(yǎng))、PuraMatrix表面組 (EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表 面)、PuraMatrix內 部 組 (EPCs于PuraMatrix內部立體培養(yǎng))和普通平面培養(yǎng)組，并根據(jù)不同檢測目的又按照使用水凝膠材料的濃度或培養(yǎng)細胞密度進一步設立亞組。

四、實驗方法

1.不同濃度水凝膠材料對EPCs的alamarBlue分析:該檢測采用Matrigel表面組、Matrigel內部組、PuraMatrix表面組和PuraMatrix內部組作為實驗組，以普通平面培養(yǎng)組為正常對照組，Matrigel的濃度分別選擇10%、20%和30%，PuraMatrix的濃度分別選擇0.25%、0.5%和1%。培養(yǎng)物中EPCs的最終細胞密度為1×106個/ml，以alamarBlue(Invitrogen，Paisley，UK)方法檢測各濃度水凝膠對EPCs的細胞毒性，并于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。細胞培養(yǎng)7 d時進行細胞毒性(細胞增殖率)檢測。實驗于96孔板上進行，每行為一組，每4列為同一個水凝膠濃度，即每個濃度、每組設4個孔。按照alamarBlue法的需要分別設單純培養(yǎng)基組、單純培養(yǎng)基＋alamarBlue組、EPCs平面培養(yǎng)＋alamarBlue組、EPCs加于 Matrigel表面＋alamarBlue組、EPCs加于PuraMatrix表 面 ＋alamarBlue組 、EPCs混 懸 于Matrigel中＋alamarBlue組和EPCs混懸于PuraMatrix中＋alamarBlue組，有水凝膠材料組的每孔50 μL水凝膠之上加50 μL培養(yǎng)基，無水凝膠組則直接加100 μL培養(yǎng)基。換液時一次換2/3或3/4量液體，避免損傷水凝膠的表面結構。需培養(yǎng)7 d的4列先加樣，2 d后需培養(yǎng)5 d的4列加樣，依次類推，最后全部達到培養(yǎng)時間時，需加alamarBlue的組分別于每孔加入10 μL alamarBlue，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標儀在570 nm和630 nm兩個波長分別測量每孔的吸光率，并使用公式計算細胞毒性/細胞增殖率。具體公式如下:

其中A為吸光率，LW為短波長即570 nm，HW為長波長即630 nm，RO為矯正參數(shù)，計算公式如下:

RO=AOLW/AOHW

其中AO是單純培養(yǎng)基＋alamarBlue組的吸光率減去單純培養(yǎng)基組的吸光率的差值。整個實驗重復3次，以得出統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2.EPCs和不同濃度水凝膠材料不同培養(yǎng)方式細胞生長情況的形態(tài)學觀察:分別于培養(yǎng)1、3、5、7 d時用倒置顯微鏡觀察上述各組中培養(yǎng)細胞的形態(tài)變化。其中由于PuraMatrix形成的水凝膠材料中可見透明條索狀物質，與培養(yǎng)后期EPCs所形成的條索狀形態(tài)難于區(qū)分，故使用Hochest33342染色法對細胞進行染色后觀察，或在細胞標記了DII熒光染色劑后再行共培養(yǎng)，于熒光顯微鏡下觀察，配套Leica成像系統(tǒng)采集圖像，立體結構采用連續(xù)多層同位拍照，使用Imagepro-Plus6.0(IPP6.0)軟件(USA)進行多層合并，得到立體結構的平面圖。

3.不同密度EPCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)情況觀察:使用1×105個/ml、1×106個/ml和1× 107個/ml三個細胞密度于前述第4點中檢測出的最適濃度Matrigel和PuraMatrix中混懸培養(yǎng)，分別進行形態(tài)學觀察和alamarBlue細胞增殖的分析。具體方法同上。

4.NSCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察。將大鼠ADSCs誘導分化的NSCs的神經球接種于最適濃度Matrigel和PuraMatrix中培養(yǎng)，觀察其生長及分化情況，并做免疫細胞化學鑒定，具體方法及抗體見本實驗室前期工作[9]。

五、統(tǒng)計學處理

所有計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，alamarBlue的結果用兩因素析因設計方差分析方法進行分析，進一步的組間的多重比較采用最小顯著性差異法(least-significant difference，LSD)的方法，不同接種密度細胞的增殖能力的檢測數(shù)據(jù)用單因素方差分析方法，進一步的組間的多重比較采用LSD的方法，所有數(shù)據(jù)均經SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)包處理，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

一、不同濃度水凝膠材料及不同培養(yǎng)方式對EPCs的alamarBlue分析

EPCs與三種濃度Matrigel共培養(yǎng)，Matrigel的細胞毒性隨濃度增高而增大，其中30%的Matrigel內部培養(yǎng)細胞毒性最大，EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強(表1)。本組數(shù)據(jù)中培養(yǎng)方式因素和Matrigel濃度因素的交互作用有顯著差異(F=7.933，P=0.006)，提示隨Matrigel濃度的增高，EPCs在其表面培養(yǎng)與在其內部培養(yǎng)，對細胞的增殖的影響有顯著差異。EPCs與3種濃度PuraMatrix共培養(yǎng)，細胞毒性也有隨濃度增高而增大的趨勢，并且也出現(xiàn)了表面較內部培養(yǎng)增殖率更高的現(xiàn)象 (表2)。而不同培養(yǎng)方式之間比較沒有顯著差異 (F= 0.448，P=0.516)，說明EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面或內部，對細胞的增殖沒有顯著影響。

二、不同濃度水凝膠材料及不同培養(yǎng)方式對EPCs的生長形態(tài)的影響

EPCs在10%的Matrigel的表面或內部培養(yǎng)均會沉降至培養(yǎng)板底部，生長方式類似普通平面培養(yǎng)(圖1)。在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，與常做的體外血管生成實驗的方法和結果類似。在20%和30%的Matrigel內部培養(yǎng)，2 d以內EPCs的形態(tài)類似圓形，分散懸于Matrigel中，20% 的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化，而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化(圖2)。EPCs在0.25%和0.5%的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細胞能夠穿入PuraMatrix中，形成在0.25%和0.5%的PuraMatrix內部培養(yǎng)類似的效果，而在1% PuraMatrix表面培養(yǎng)的EPCs則很少穿入PuraMatrix中，僅在PuraMatrix表面鋪展生長。在0.25%的PuraMatrix內部培養(yǎng)的細胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix內部培養(yǎng)7 d能夠觀察到成管化現(xiàn)象(圖3)。

三、不同密度EPCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察

根據(jù)AlamarBlue實驗的結果可知20%Matrigel 和0.5%PuraMatrix是最適合EPCs生長的濃度。因此在20%Matrigel和0.5%PuraMatrix內部以1×105個/ml、1×106個/ml和1×107個/ml 3種細胞密度分別接種EPCs，觀察EPCs增殖情況發(fā)現(xiàn)1×105個/ml的增殖情況較差，而1×106個/ml和 1×107個/ml 2種密度比較無明顯差異(表3)。在20%Matrigel中EPCs以1×105個/ml、1×106個/ml和1×107個/ml 3種細胞密度接種均能夠形成條索狀結構，其密度隨細胞接種密度增加而增加(圖4)。而在0.5%PuraMatrix 中EPCs以1×105個/ml細胞密度接種時，很難形成微管狀結構，1×106個/ml中可以形成條索狀結構，而1×107個/ml則很容易形成，管徑大小不同，并且互相交聯(lián)呈網狀結構(圖5)。

表1 Matrigel的細胞毒性(x±s，n=3)

表2 PuraMatrix的細胞毒性(x±s，n=3)

表3 20%Matrigel和0.5%PuraMatrix中的不同密度細胞的增殖情況(x±s，n=3)

圖1 10%Matrigel中EPCs沉于底部，平面生長(×200)

四、NSCs于最適濃度水凝膠材料中培養(yǎng)的情況觀察

NSCs的神經球直接接種于 20%Matrigel和0.5%PuraMatrix中，觀察發(fā)現(xiàn)神經球中的細胞會逐漸向球外遷移，并開始長出具有分支的細胞。對培養(yǎng)10 d的NSCs進行免疫細胞化學染色，發(fā)現(xiàn)神經球局部仍有較多Nestin陽性細胞，但遷移出來的細胞具有多個較長突起的往往表達GFAP陽性，且其細胞核往往肥大，具有細長突起的細胞胞體被Neun染色，0.5%PuraMatrix中NSCs分化得更快，并且分化獲得神經元樣細胞更多(圖6)。

討論

生物工程是20世紀70年代初開始興起的一門新興的綜合性應用學科，在醫(yī)學領域的應用主要是以生物學的理論和技術為基礎，結合現(xiàn)代工程技術，以生產有用代謝產物或發(fā)揮它們獨特生理功能的一門新興技術。在創(chuàng)傷修復方面則主要以合適的干細胞結合生物組織工程材料共移植的方式。在神經系統(tǒng)的修復中早期有關于嚙齒類動物的干/祖細胞與聚乙交酯PGA和聚丙交酯PLA以及它們的聚合物聚乳酸-羥基乙酸共聚物 [poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]相容性的文章[4,10-12]，但是由于PLGA是一種硬材料，使用其作為中樞神經損傷的移植材料，需將其填塞入損傷空腔，會造成2次損傷，不是理想的材料。一種理想的中樞神經組織修復的生物材料應該具有能夠與干細胞混合并可注射入損傷空腔中的液體形態(tài)，一旦移植入體內則很快凝固，并構成三維支架供細胞攀附的特性。Matrigel和PuraMatrix是兩款細胞相容性較好的水凝膠，近期已經有將它們的生物相容性與其他常用生物細胞支架相比較的文獻[13,14]，研究結果表明盡管細胞的存活率和分化能力有些許不同，但水凝膠材料和其他支架性材料具有可比性。

圖2 Matrigel中細胞生長情況

圖3 EPCs與PuraMatrix共培養(yǎng)情況

圖4 EPCs以1×107個/ml密度接種于20%Matrigel中形成的網格狀微管系統(tǒng)

圖5 EPCs以1×107個/ml密度接種于0.5%PuraMatrix中形成的網格狀微管系統(tǒng)

圖6 光鏡下觀察NSCs在水凝膠中培養(yǎng)有細胞遷移出神經球，并且細胞形態(tài)有改變，細胞伸出突起

在本次實驗中EPCs與三種濃度Matrigel共培養(yǎng)，Matrigel的細胞毒性隨濃度增高而增大，其中30%的Matrigel內部培養(yǎng)細胞毒性最大，EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細胞增殖率高，而且此差異隨Matrigel的濃度增高而增強。這個結果與Thonhoff等[9]的實驗結果不完全相符，其原因可能是Thonhoff等[9]使用的Matrigel是含生長因子的，所以在其濃度增加時，雖然材料本身的細胞毒性增加，但生長因子的濃度也增加，所以在1%~10%濃度時細胞增殖率/存活率下降，但當濃度增加至50%時，細胞的增殖率/存活率反而上升。而本實驗所采用的Matrigel為去除生長因子的，所以可以客觀的反應出細胞毒性隨材料濃度增加而增加的趨勢。EPCs與三種濃度PuraMatrix共培養(yǎng)，細胞毒性也有隨濃度增高而增大的趨勢，并且也出現(xiàn)了表面較內部培養(yǎng)增殖率更高的現(xiàn)象。而三種濃度的PuraMatrix中1%的PuraMatrix細胞毒性較大。這與目前多數(shù)實驗結果相符[13,14]。這種細胞毒性反應可能是因為材料降解所釋放的毒性或酸性產物造成的。

理想的水凝膠材料除了應具有低生物毒性外，還應具有不干擾移植細胞的正常生理功能的性質。實驗中EPCs在水凝膠中能夠成管化，這與早期的一些實驗結果一致[15-19]。在本實驗中EPCs在10%的Matrigel的表面或內部培養(yǎng)均會沉降至培養(yǎng)板底部，生長方式類似普通平面培養(yǎng)，說明10%的Matrigel孔徑過大，或粘稠度不足以使EPCs抵抗重力影響，所以雖然其細胞毒性最小，但不適于用于生物工程組織修復。而EPCs在20%和30%的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化，與常做的體外血管生成實驗的方法和結果類似，說明20%和30%的Matrigel的結構較難使EPCs遷入。EPCs在20%和30%的Matrigel內部培養(yǎng)，2 d以內EPCs的形態(tài)類似圓形，分散懸于Matrigel中，20%的Matrigel中培養(yǎng)7 d能夠立體成管化，而30%的Matrigel中，EPCs僅能伸出少數(shù)突起，不能成管化，說明20%的Matrigel的密度較適合EPCs在其內部成管化，而30%的Matrigel則密度過大。EPCs在0.25%和0.5% 的PuraMatrix表面培養(yǎng)，細胞能夠穿入PuraMatrix中，形成在0.25%和0.5%的PuraMatrix內部培養(yǎng)類似的效果，而在1%PuraMatrix表面培養(yǎng)的EPCs則很少穿入PuraMatrix中，僅在PuraMatrix表面鋪展生長。在0.25%的PuraMatrix內部培養(yǎng)的細胞可附著于材料上，但較難成管化，0.5%的PuraMatrix內部培養(yǎng)7 d能夠觀察到成管化現(xiàn)象，分析其原因可能是0.25%的PuraMatrix形成的支架網格孔徑過大，細胞之間較難形成聯(lián)系，而0.5%的PuraMatrix的孔徑較合適。這與Narmoneva等[13]的研究結果不完全符合，在他們的研究中使用了自組裝短肽水凝膠與大鼠脂肪組織來源的微血管ECs進行體外血管新生的生物工程研究，他們認為1%的自組裝短肽水凝膠為合適的濃度，而本次實驗中為0.5%的PuraMatrix，這可能是因為筆者采用PuraMatrix中氨基酸組成成分與他們所使用的短肽不同。另外成管化的時間也不同，他們的實驗中16 h即可成管化，而本次的實驗中2 d以內都沒有明顯的成管化現(xiàn)象，分析其原因可能是EPCs需要先分化為成熟的ECs再成管化。

理想的水凝膠材料應具備的另一個屬性即不妨礙移植細胞的正常分化能力。本實驗中NSCs在Matrigel中分化時，星形膠質細胞較多，而神經元較少，這與Thonhoff等[9]的實驗結果類似，對于這一點他們的分析是認為Matrigel對神經元毒性較大所致，而筆者認為除此之外還有可能是因為Matrigel的微環(huán)境更利于NSCs向星形膠質細胞的方向分化，因為在用同源性的EPCs做細胞毒性實驗時，20%Matrigel與0.5%PuraMatrix的細胞增殖率的數(shù)據(jù)類似，說明并不一定是因為細胞毒性的問題。另外本實驗中觀察到在Matrigel中分化的星形膠質細胞細胞核都較肥大，Albrecht等[20]的研究認為活化的星形膠質細胞具有肥大的細胞核，所以推測在Matrigel中分化的星形膠質細胞細胞均處于被活化的狀態(tài)。由于Matrigel的成分復雜，所以尚不知是其中的一個還是數(shù)個成分導致這樣的細胞形態(tài)改變。本次實驗的結果與Flanagan等[21]和Katakowski等[22]的結果不同，可能是因為筆者采用的Matrigel濃度與他們不同，且采用的Matrigel不含生長因子成分。盡管檢測神經系的三種重要細胞標記物是必要的，但在體外很少能夠在NSCs分化后2~3周以內檢測到少突膠質細胞的標記物O4，但由于水凝膠材料的降解及體外培養(yǎng)時每次換液都有可能造成的材料損失或稀釋，導致在體外觀察時間不夠長，本實驗在體外分化10 d，已經是目前已有研究中較長的，尚不足以觀察和檢測少突膠質細胞的標記物。體外誘導分化用于移植的神經元通常將NSCs培養(yǎng)于多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板上，將獲取的神經元嫁接入神經元缺損區(qū)域的策略[19]。而將NSCs植入水凝膠中則模擬了體內模型，但在這個實驗中進行免疫細胞化學染色時，細胞損失非常大，無法進行嚴格的細胞數(shù)量統(tǒng)計。而且本實驗將神經球置于水凝膠材料內部培養(yǎng)，模擬了正常生物組織中細胞處于細胞基質和各種支架之間的生理狀態(tài)，較早期的將神經干/祖細胞置于Matrigel表面培養(yǎng)觀察其遷移和分化的研究更有意義[20,21,23]。

因為PuraMatrix能夠在相當較低的濃度凝膠化，并且對細胞毒性相對較小，所以本實驗中神經球在PuraMatrix中表現(xiàn)出細胞遷移和接近正常比例的膠質細胞及神經元分化能力似乎是理所應當。盡管在體外培養(yǎng)過程中細胞遷移的距離較正常培養(yǎng)方式的神經球近，可能是因為PuraMatrix凝膠化后形成的纖維有一定的阻隔作用，但有理由相信在移植入體內后，由于PuraMatrix的纖維網絡提供了供細胞攀附和遷移的三維支架，能夠促進神經組織缺失的修補。

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Compatibility of rodent epithelial progenitor cells with biomaterial hydrogels in vitro

Xue Shan1, Wu Gang2,Luo Shiyu3,Zhang Peng4,Zhang Hongtian4,Fa Zhiqiang1,Guo Yanwu1,Ke Yiquan1,Xu Ruxiang4.1Department of Neurosurgery,Neurosurgery Institute,Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration of Guangdong Province,Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282,China;2Department of Oncology,Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282,China;3Second Clinical College of Southern Medical University,Guangzhou 510282, China;4The Affiliated Bayi Brain Hospital,The Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

ObjectiveTo test the interaction of in vitro cultured cells and biological engineering hydrogel materials,providing theoretical basis for the treatment strategy of in vitro culturedcells and biological engin eering hydrogel transplantation.MethodsTwo different components hydrogel Matrigel and PuraMatrix were used as experimental material,and EPCs derived as previous method used as detecting cells.At different concentrations of Matrigel(10%,20%,30%)or PuraMatrix (1%,0.5%,0.25%),EPCs were cultivated on surface or within the hydrogels.Observe the morphology and detect cell proliferation by Alamar Blue method in different time to determine the cytotoxicity of hydrogel materials.Observe the in vitro angiogenesis ability of EPCs to detect whether cells still have physiological function.Resultsthree concentrations of Matrigel,30%Matrigel is highest cytotoxicity. Among three PuraMatrix concentration,1%PuraMatrix is highest cytotoxicity.The cell proliferation rate of EPCs training on surface of Matrigel is high than suspension in Matrigel,and the difference between these two training mode enhanced while the concentration of Matrigel increased.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed on 20%and 30%Matrigel surface.EPCs descended to the bottom when cultured in or on surface of 10%Matrigel 7 days.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed in 20%Matrigel,but in 30%Matrigel,EPCs only stretch minority pustute.The cell proliferation rates were no significant differences when EPCs training on surface of or in 0.25%and 0.5%PuraMatrix.But when EPCs training on surface of or in 1%PuraMatrix,the survival rate of cell is very low.EPCs can migrat in 0.25%and 0.5%PuraMatrix when cultured on surface.But in 0.25% PuraMatrix,EPCs attached to the material,but had difficult to perform in vitro angiogenesis.The in vitro angiogenesis ability of EPCs was observed in 0.5%PuraMatrix.Among three densitys of EPCs,density of 107cell/ml in vitro angiogenesis are more easily.In the hydrogel.ConclusionMatrigel and PuraMatrix in the appropriate concentration (20%)and 0.5%have good compatibility with EPCs and NSCs,and can serve as support,imitate physiological condition,to provide a three-dimensional cell growth environment,non-toxic degradation products,may be more suitable for transplantation treatment.

Endothelial progenitor cells; Hydrogel;Biocompatibility

2015-07-10)

(本文編輯:張麗)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.06.008

國家自然科學基金(u0632008、30801184、30772232、30500526、81501046)廣東省自然科學基金(S2011040003565)

510282廣州，南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經外科，神經外科研究所1；廣東省腦功能修復和再生重點實驗室南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院腫瘤中心2；南方醫(yī)科大學第二臨床學院3；100700北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院4

徐如祥，Email:zjxuruxiang@163.com

薛杉,吳鋼,羅詩雨,等.嚙齒動物上皮祖細胞與生物材料水凝膠生物相容性的體外研究[J/CD].中華神經創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(6)：346-353.