蔡杏珊 王嫩寒 周輝林 張潔 梁啟德 田麗麗 許蘊怡 任怡宣 譚耀駒 丁北川

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·論著·

改良萋-尼染色法檢測分枝桿菌的效果評價

蔡杏珊 王嫩寒 周輝林 張潔 梁啟德 田麗麗 許蘊怡 任怡宣 譚耀駒 丁北川

目的 評估改良萋-尼染色液染色鏡檢分枝桿菌在痰涂片中的檢測效能。方法 2014年6月至2014年9月于北京結(jié)核病控制研究所和廣州市胸科醫(yī)院順序納入就診，按照臨床癥狀和體征、臨床相關(guān)檢測判斷為可疑肺結(jié)核病患者835例痰標本共1024份(北京結(jié)核病控制研究所435例505份痰標本，廣州市胸科醫(yī)院400例519份痰標本)，分別涂片進行傳統(tǒng)萋-尼染色法(三步法)鏡檢、改良萋-尼染色法(二步法)鏡檢和簡單法固體羅氏培養(yǎng)(L-J法)，比較兩種染色方法結(jié)果的一致性，并以L-J法結(jié)果為金標準，比較兩種染色法陽性檢出率的差異、診斷的準確性及可操作性。結(jié)果 改良萋-尼染色法和傳統(tǒng)萋-尼染色法的陽性檢出率分別為11.62%(119/1024)和11.91%(122/1024)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.18,P>0.05)，兩法有良好的一致性(Kappa>0.75)；以L-J法結(jié)果為金標準，改良萋-尼染色和傳統(tǒng)萋-尼法檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為52.94%(90/170)和56.47%(96/170)；97.66%(834/854)和96.96%(828/854)。以上兩種方法的ROC曲線下面積分別是0.76和0.77，有中等的診斷價值。結(jié)論 改良萋-尼染色法在檢出分枝桿菌方面比傳統(tǒng)萋-尼染色法有較好的敏感度與特異度，對于診斷肺結(jié)核有較好的診斷價值。

結(jié)核, 肺/診斷; 結(jié)核分枝桿菌； 染色與標記； 顯微鏡檢查; 敏感度與特異度

結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是全世界范圍內(nèi)嚴重危害人們健康的常見傳染病之一[1]。我國是全球結(jié)核病高負擔國家之一[2]，涂片染色鏡檢找分枝桿菌的實驗室診斷方法因其簡單快捷、成本低，目前仍然是我國實施結(jié)核病防治規(guī)劃的重要手段。傳統(tǒng)萋-尼染色法(三步法)一直在使用并不斷改良[3]，改良萋-尼染色法(二步法)在傳統(tǒng)萋-尼染色法的基礎上將第二步的鹽酸酒精脫色與美蘭復染液合二為一，省略了中間一個步驟，因而變得更簡捷。為檢驗改良萋-尼染色法應用效能，本研究通過此方法檢測835例疑似肺結(jié)核患者的痰標本共1024份，同時與三步法相比較，以簡單法固體羅氏培養(yǎng)(L-J培養(yǎng)法)結(jié)果為金標準，研究其對分枝桿菌檢出的敏感度和特異度，探討改良萋-尼染色法在實驗室的應用前景。

材料和方法

一、標本來源

順序納入2004年6月至2014年9月于北京結(jié)核病控制研究所和廣州市胸科醫(yī)院就診，按照臨床癥狀和體征、臨床相關(guān)檢測判斷為疑似肺結(jié)核患者835例痰標本共1024份(北京結(jié)核病控制研究所435例505份痰標本，廣州市胸科醫(yī)院400例519份痰標本)，分別進行涂片傳統(tǒng)萋-尼染色法鏡檢、改良萋-尼染色法鏡檢和L-J培養(yǎng)法檢測。

二、儀器與試劑

1.儀器：光學顯微鏡為奧林巴斯CX21，產(chǎn)自日本，采用100倍油鏡觀察。

2.試劑：傳統(tǒng)萋-尼染色法染色液和改良萋-尼染色法染色液均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。酸性羅氏培養(yǎng)基嚴格按照《全國結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[4]配制。

三、 方法

(一)痰涂片抗酸染色鏡檢

取0.20 ml痰標本涂抹制備2張?zhí)的て?，分別進行傳統(tǒng)萋-尼染色法及改良萋-尼染色法鏡檢查找分枝桿菌。操作方法照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃—痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[5]進行。

1.改良萋-尼法操作過程：(1)涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10 mm以上的距離；加熱固定(在5 s內(nèi)將玻片經(jīng)過火焰加熱4次)。(2)滴加石碳酸復紅溶液(Carbolfuchsin)(第一液)蓋滿玻片，染色10 min。(3)流水沖去初染色液后，滴加酸性乙醇美藍溶液(第二液)蓋滿玻片，脫色1～2 min；如痰膜片過厚，需流水洗去酸性乙醇美藍溶液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。流水沖去復染液，瀝干水，待玻片干燥后進行鏡檢。

2.傳統(tǒng)萋-尼染色法操作過程[6]：(1)涂片自然干燥后，放置在染色架上。(2)滴加石碳酸復紅溶液(第一液)，蓋滿玻片，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5 min。(3) 流水沖去第一液后加入脫色劑(第二液)，脫色1 min；如殘留塊狀紅色，流水洗去脫色液后再次脫色至痰膜無可視紅色為止。(4) 滴加亞甲藍復染液(第三液)蓋滿玻片，染色30 s，流水沖去復染液，瀝干水，待玻片干燥后進行鏡檢。

(二)L-J培養(yǎng)法

每份痰標本同時接種于兩管酸性羅氏培養(yǎng)基上，具體操作步驟見文獻[7]。

四、質(zhì)量保證

萋-尼染色液及酸性L-J培養(yǎng)法培養(yǎng)基均采用分枝桿菌標準菌株進行染色及生長試驗驗證，L-J培養(yǎng)法培養(yǎng)基經(jīng)無菌測試合格后使用。涂片染色及培養(yǎng)過程中均同時采用陰陽性對照進行質(zhì)量控制，其中涂片染色采用恥垢分枝桿菌標準菌株ATCC11845模似痰作陽性對照，正常人呼吸道分泌物作陰性對照。培養(yǎng)則采用H37Rv結(jié)核分枝桿菌標準菌株作陽性、無菌水作陰性對照。對于同一份標本的兩種不同方法染色的痰膜片采用盲法進行鏡檢操作。

五、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0對改良萋-尼染色法鏡檢和傳統(tǒng)萋-尼染色法鏡檢結(jié)果進行一致性檢驗(Kappa檢驗)，Kappa≥0.75認為兩者一致性較好；陽性率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；用ROC曲線下面積評價2種染色方法診斷肺結(jié)核的價值。完全無價值的診斷試驗曲線下面積為0.5，理想的診斷試驗曲線下面積為1，而一般認為對于一個診斷試驗，ROC曲線下面積在0.5～0.7之間時診斷價值較低，在0.7～0.9之間時診斷價值中等，在0.9以上時診斷價值較高[8]。

結(jié) 果

一、傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法的可操作性及鏡下比較

改良萋-尼染色法，是將傳統(tǒng)萋-尼染色法的脫色液與復染液整合在一起，一液達到脫色與復染雙重目的，可操作性比傳統(tǒng)萋-尼染色法更強；兩法的鏡下染色良好，分枝桿菌均呈紅色，其他細菌及白細胞、上皮細胞等背景顏色為藍色(圖1、2)。

二、傳統(tǒng)-萋尼染色法與改良萋-尼染色法對痰涂片的陽性檢出率比較及一致性分析

傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法的陽性率分別是11.91%(122/1024)和10.74%(110/1024)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.18,P>0.05)；對兩法進行Kappa檢驗，Kappa=0.82>0.75,兩法具有較好的一致性。

表1 傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法結(jié)果比較

三、傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法鏡檢結(jié)果對診斷肺結(jié)核患者的價值比較

以L-J培養(yǎng)法檢測結(jié)果為診斷肺結(jié)核的金標準，分析傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法鏡檢結(jié)果的準確性(表2)。傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法的敏感度和特異度分別為56.47%(96/170)和52.94%(90/170)；96.96%(828/854)和97.66% (834/854)(表2)。上述兩種方法的檢測結(jié)果分別與L-J培養(yǎng)法檢測結(jié)果繪制成診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線(圖3，4)。從圖3看出，改良萋-尼染色法診斷肺結(jié)核患者的ROC曲線下面積為0.76，與傳統(tǒng)萋-尼染色法的0.77相接近，均具有中度的診斷價值。

表2 L-J培養(yǎng)法與傳統(tǒng)萋-尼染色法、改良萋-尼染色法結(jié)果比較

注 “敏感度”與“特異度”是以“L-J培養(yǎng)法”檢測結(jié)果為金標準

討 論

分枝桿菌為細長略帶彎曲的桿菌，其細胞壁脂質(zhì)含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入。萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色法廣泛應用于結(jié)核病的診斷[9]，以5% 石炭酸復紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色[10]。若再加用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細菌和背景中的物質(zhì)為藍色。本研究的改良萋-尼染色法，采用特殊的滲透劑使復紅能快速穿透結(jié)核分枝桿菌表層屏障，使菌體著色牢固、同時將傳統(tǒng)萋-尼染色法的脫色液與復染液結(jié)合在一起，—95%乙醇、3%鹽酸、0.5%亞甲蘭，省略了一個染色環(huán)節(jié)，減少操作者的生物安全危險性，同時達到脫色與復染的雙重目的，而且鏡下染色結(jié)果與傳統(tǒng)萋-尼染色法同樣清晰。

本研究表明：傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩法的一致性較好(Kappa>0.75),說明改良萋-尼染色法可以媲美于傳統(tǒng)萋-尼染色法。但仍有38例兩種方法檢測結(jié)果互相不符合，其中25例是傳統(tǒng)法陽性改良萋-尼染色法陰性，13例是改良萋-尼染色法陽性傳統(tǒng)法陰性，原因可能是改良萋-尼染色法對于操作者來說還是新方法，第二液的脫色復染的時間掌握得不夠好，脫色時間稍有延長，抗酸性較弱的分枝桿菌初染紅色會被脫掉，同時美藍上色過深也影響了鏡檢結(jié)果，造成了少量改良萋-尼染色法的假陰性；另外分枝桿菌在痰液中分布的不均一性或菌量少于5000～10 000條/ml，也是兩種染色方法結(jié)果部分差異的原因。

以L-J培養(yǎng)檢測結(jié)果為金標準，進一步分析傳統(tǒng)萋-尼染色法與改良萋-尼染色法檢測結(jié)果的準確性，本研究說明改良萋-尼染色法雖可媲美于傳統(tǒng)法，但與金標準“L-J培養(yǎng)”檢測結(jié)果比較，兩種染色方法檢測的敏感度較差[11]，但特異度則比較高。

綜上所述，改良萋-尼染色法鏡下菌體色彩鮮明、對比度強、背景清晰，對分枝桿菌的檢出率可媲美于傳統(tǒng)萋-尼染色法，有較好的敏感度與特異度，在診斷結(jié)核病上有較好的準確度，而且比傳統(tǒng)萋-尼染色法省略了一個步驟，可以減少操作，縮短時間、提高工作效率，增加生物安全系數(shù)，是一種簡單、安全、準確的分桿菌菌涂片染色方法。但在操作過程中需注意掌握好第二液的脫色復染時間，方可提高涂片鏡檢的陽性率。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing: WHO report 2008. Geneva: World Health Organization, 2008.

[2] 趙雁林，尚美. 我國當前結(jié)核病實驗室診斷的現(xiàn)狀. 中華檢驗醫(yī)學雜志，2007,30(7)：97-98.

[3] 吳敏，艾義明.結(jié)核桿菌抗酸染色中美蘭與孔雀綠復染液比較.中國防癆雜志，2007，29(3)：288-289.

[4] 中國防癆協(xié)會基礎委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.中國教育文化出版社，2006：30-45.

[5] 中國疾病預防控制中心.中國結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊. 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2004.

[6] 趙雁林.結(jié)核菌痰涂片顯微鏡檢查標準化培訓教材.人民衛(wèi)生出版社,2009:10-14.

[7] 趙雁林．分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：4．

[8] 虞仁和．SPSS18及其醫(yī)學應用．長沙：中南大學出版社，2013：232-233.

[9] 張登才,劉斌,張麗華.等.抗酸染色在結(jié)核病病理診斷中的價值. 中國防癆雜志,2014,36(4):274-278.

[10] 張嫻. 萋-尼氏抗酸染色法的操作改良及效果. 浙江預防醫(yī)學,2010,22(10)：95-96.

[11] Van Deun A,Hamid Salim A，Aung KJ,et a1．Performance of variations of carbolfuchsin staining of sputum smears for AFB under field conditions．Int J Tuberc Lung Dis, 2005, 9(10):1127-1133．

(本文編輯：范永德)

《中國防癆雜志》協(xié)辦單位名單(名單順序按照協(xié)議簽署時間排列)

1.北京金之路醫(yī)藥科技有限公司

2.北京結(jié)核病控制研究所

3.山東省胸科醫(yī)院

4.武漢市結(jié)核病防治所

5.沈陽雙鼎制藥有限公司

6.西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院

7.深圳市龍華新區(qū)慢性病防治中心(精神衛(wèi)生中心)

本刊編輯部

Evaluation of improved Ziehl-Neelsen acid-fast staining method for detecting mycobacteria

CAIXing-shan*,WANGNen-han,ZHOUHui-lin,ZHANGJie,LIANGQi-de,TIANLi-li,XUYun-yi,RENYi-xuan,TANYao-ju,DINGBei-chuan.

*GuangzhouChestHospitalClinicalLaboratory,Guangzhou510095，China

DINGBei-chuan,Email:bchding@163.com；TANYao-ju，Email:gzchtan@163.com

Objective To assess the efficiency of improved Ziehl-Neelsen (ZN) acid-fast staining method to detect mycobacteria in sputum. Methods A total of 1024 sputum specimens of 835 suspected pulmonary tuberculosis patients from Beijing Institute of TB Control TB control(505 sputum specimens of 435 patients) and Guangzhou Chest hospital(519 sputum specimens of 400 patients) from June 2014 to September 2014 were detected by conventional ZN acid-fast staining method (3 step method), improved ZN acid-fast staining method (2 step method) and Lownstein-Jenson (L-J) culture respectively. Setting the L-J culture as golden standard, the positive rate, diagnostic accuracy and operability were compared between two staining methods. Results The positive rate of improved ZN acid-fast staining method and conventional ZN acid-fast staining method was 11.62%(119/1024) and 11.91% (122/1024), respectively. No difference was observed between two group (χ2=3.18,P>0.05), and they have good consistency (Kappa>0.75). The sensitivity and specificity were 52.94% (90/170) and 97.66% (834/854) for improved ZN method, and 56.47% (96/170) and 96.96% (828/854) for conventional method, respectively. The areas under the ROC curve of these two methods were 0.76 and 0.77, respectively, demonstrating that both of them had medium diagnostic value. Conclusion Our results show that improved ZN acid-fast staining method has better sensitivity and specificity for detecting mycobacteria, which can provide favorable diagnostic value in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis;Mycobacteriumtuberculosis； Staining and labeling； Microscopy; Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.006

廣州市科技計劃項目(201508020007)

510095 廣州市胸科醫(yī)院檢驗科(蔡杏珊、周輝林、梁啟德、許蘊怡、譚耀駒)；北京結(jié)核病控制研究所檢驗科(王嫩寒、張潔、田麗麗、任怡宣、丁北川)

丁北川，Email:bchding@163.com；譚耀駒，Email:gzchtan@163.com

2015-04-30)