宋祖榮

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一.在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，糖尿病的病因及發(fā)病機制還不是完全清楚，但主要涉及到遺傳、代謝、自身免疫等方面，是多種致病因素共同所致；因此，目前缺乏病因的有效治療方法，缺乏針對性的防治藥物.通過相關(guān)研究表明[1]，蛋白激酶C(Protein KinaseC，PKC)與轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF-β1)與早期DN的發(fā)生有著十分密切的聯(lián)系.在祖國醫(yī)學(xué)中糖尿病被稱為消渴病，而益氣活血法是臨床上治療糖尿病的常用中醫(yī)治法.本實驗主要研究觀察益氣活血方對早期DA大鼠模型血清中甘油三脂(Triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，Chol)水平變化的影響，同時觀察對腎臟組織中PKC、TGF-β1的表達(dá)，探討益氣活血方對早期DA的影響及其作用機制.

1 材料

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠80只，體重200g~240g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK(蘇)2002-0031.

1.2 藥物與試劑

益氣活血方(腦絡(luò)欣通)：黃芪30g、三七10g、川芎10g、紅花6g等，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室制備；Z20071185)；依那普利(杭州賽諾菲民生制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：J20030113)；鏈脲佐菌素(Streptozin，STZ，美國Sigma公司)；TGF-β1（兔多抗，上?？婆d商貿(mào)有限公司）；PKC(兔多抗，上海麗臣商貿(mào)有限公司)；PKC試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司).

1.3 儀器

ASP200組織脫水機（德國Leica公司），TB-718生物組織自動包埋機（湖北孝感泰維電子設(shè)備有限公司），LKB超薄切片機（日本太陽株式會社產(chǎn)品），TR-180II型生物組織全自動染色機（湖北泰維科技實業(yè)有限公司）TK-218I恒溫攤片拷片機（湖北孝感泰維電子設(shè)備有限公司），Olympas BX-53光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)株式會社產(chǎn)品），DP801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)（江蘇南京捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）.

2 方法

2.1 DN模型大鼠復(fù)制方法

SD雄性大鼠，用普通飼適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用試紙法檢測尿糖、尿蛋白陰性后，隨機抽取11只作為正常組；其余69只大鼠作為造模組，按文獻(xiàn)方法行左側(cè)腎臟切除術(shù)+STZ復(fù)制DN模型[2].造模前禁食12h，造模成功后一周，造模組按30mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射STZ，正常組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液.72h后經(jīng)大鼠尾靜脈采血測血糖，空腹血糖(FBG)≥16.7mmol/L，而且出現(xiàn)多飲、多食、多尿等臨床表現(xiàn)，可以確認(rèn)為糖尿病模型.在連續(xù)喂養(yǎng)8周后，測24h尿蛋白定量≥20mg，為DN造模成功.在造模過程中死亡5只，造模成功64只.

2.2 分組及給藥

將造模成功的64只大鼠隨機分為空白對照組(11只)、依那普利組11只(1.04mg/kg/d)；益氣活血方大劑量組(觀察組1，14只)21.8g/kg/d；益氣活血方中劑量組(觀察組2，14只)10.9g/kg/d；益氣活血方小劑量組(觀察組3，14只)5.45g/kg/d.正常組、空白對照組同樣方法予以等量的生理鹽水灌胃，每天給藥1次，各組連續(xù)給藥12W.

2.3 取材及指標(biāo)的測定

于末次給藥后，禁食不禁飲12h，用10%水合氯醛麻醉(3.6mL/kg BW，ip)大鼠，取仰臥位，行胸腹聯(lián)合正中切口，充分暴露心臟及右腎，各組于心臟采血，肝素抗凝，測定血清TG、Chol；然后，摘取右腎，剝離腎包膜，稱重，切取腎組織，置

于100ml的10%中性甲醛溶液中固定48h后，脫水、透明、浸蠟、包埋后，采用免疫組化法測定腎臟組織中PKC、TGF-β1表達(dá).

2.4 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)均采用IBM SPSSStatistics20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的血清中TG、Chol水平的比較

DN空白對照組大鼠的血清TG和Chol水平均明顯高于正常組、依那普利組以及益氣活血方組.其中，益氣活血方組的三個劑量組均可顯著降低血清TG和Chol水平，尤以大劑量組的效果最優(yōu)，詳見表1.

表1 對各組大鼠的血清中總TG、Chol的影響

表1 對各組大鼠的血清中總TG、Chol的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01.

組別 例數(shù) TG(mmol/L)CHOL(mmol/L)正常組 11 0.68±0.16* 1.35±0.26*空白對照組 11 1.58±0.86 2.55±0.35依那普利組 11 1.53±0.27* 2.34±0.43*觀察組1(小劑量組) 14 1.49±0.29* 2.17±0.14*觀察組2(中劑量組) 14 1.13±0.17* 2.03±0.26*觀察組3(大劑量組) 14 0.67±0.14**1.48±0.37**

3.2 各組大鼠腎組織PKC、TGF-β1指標(biāo)表達(dá)情況比較

DN空白對照組大鼠的腎組織PKC、TGF-β1表達(dá)均明顯高于正常組、依那普利組以及益氣活血方組.其中，益氣活血方組的三個劑量組均可顯著降低PKC、TGF-β1表達(dá)，尤以大劑量組的效果最優(yōu)，詳見表2.

表2 對各組大鼠腎組織PKC、TGF-β1指標(biāo)表達(dá)的影響

表2 對各組大鼠腎組織PKC、TGF-β1指標(biāo)表達(dá)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01.

組別 例數(shù) TGF-β1 PKC正常組 11 2.01±1.04*0.066±0.015*空白對照組 11 5.86±1.15 0.429±0.013依那普利組 11 4.17±1.22*0.317±0.014*觀察組1(小劑量組) 14 4.10±1.43*0.306±0.017*觀察組2(中劑量組) 14 3.66±1.37*0.259±0.020*觀察組3(大劑量組) 14 2.65±0.83**0.195±0.016**

4 討論

糖尿病屬于內(nèi)分泌-代謝性疾病，是以高血糖為特征的病變，是危害人類健康的重大疾病之一；其發(fā)展會引起糖尿病腎病等合并癥，通過相關(guān)的實驗研究發(fā)現(xiàn)[3]，在糖尿病早期血清中的TG、Chol等即已升高，且隨著腎臟損害的加重，血脂紊亂更加嚴(yán)重.同時近年來，隨著對細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)對糖尿病并發(fā)癥作用的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)二脂酰甘油(Diacylglycerol，DAG)-蛋白激酶C(PKC)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活及TGF-β1的高表達(dá)與早期DN的發(fā)生密切相關(guān).而PKC廣泛存在于機體的組織細(xì)胞內(nèi)，主要以非活性形式存在于細(xì)胞漿中，以活性形式結(jié)合于細(xì)胞膜，是細(xì)胞內(nèi)重要的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng).PKC活化在DN的發(fā)生過程中起關(guān)鍵性作用[4,5]，PKC活化后，首先誘導(dǎo)有絲裂原活化蛋白激酶(MEK)，再進(jìn)一步活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，ERK被激活后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核誘導(dǎo)TGF-β基因表達(dá)[6].TGF-β 的分布有一定的組織特異性，腎臟以TGF-β1為主，TGF-β1能夠促進(jìn)系膜細(xì)胞攝取葡萄糖，同時葡萄糖又可以增加TGF-β1表達(dá)，從而形成了惡性循環(huán)，不斷地加重了DN病變過程[7,8].

益氣活血法是治療DN常用治法[9].在祖國醫(yī)學(xué)中，DN多屬于“消渴”的范疇，古代醫(yī)家一般認(rèn)為，消渴病的發(fā)生多與飲食不節(jié)，情志失調(diào)，先天稟賦不足等因素有關(guān)；但其根本病因是由于病變?nèi)站脤?dǎo)致腎氣虧虛而成，而氣虛無力行血，致血行不暢而成瘀.因此，DN的病機主要與氣虛血瘀有關(guān)[10]，而痰飲、水濕等亦可導(dǎo)致血瘀的發(fā)生.因而作為益氣活血法的代表方腦絡(luò)欣通，可以通過益氣以助血行，活血以暢通氣血；而氣行則水行，氣盛則可推動津液在體內(nèi)的運行，防治痰飲、水濕在體內(nèi)的停聚，進(jìn)而防止淤血的產(chǎn)生.

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過STZ復(fù)制DN模型大鼠血清中Chol、TG水平顯著高于正常組，同時腎組織PKC、TGF-β1表達(dá)也增強；而與正常組比較，益氣活血方各組大鼠血清中Chol、TG水平顯著降低，同時PKC、TGF-β1表達(dá)也顯著降低，尤其是大劑量組明顯優(yōu)于中劑量組和小劑量組.因此本研究表明，益氣活血方可以通過抑制PKC、TGF-β1的活化，減少系膜細(xì)胞攝取葡萄糖，進(jìn)而，減少腎小球系膜外基質(zhì)增生，有效的延緩腎小球纖維化的進(jìn)程，從而達(dá)到保護(hù)腎臟的功效；同時益氣活血方可以通過降低血清中Chol、TG水平，來調(diào)節(jié)脂質(zhì)的代謝，從而延緩早期DN病程的進(jìn)一步發(fā)展.

〔1〕陳云,李賽美,王保華.降糖三黃片對糖尿病腎病大鼠腎組織蛋白激酶C 和轉(zhuǎn)化生長因子β1 的影響[J].中醫(yī)雜志,2012,53(8):689-692.

〔2〕邢淑麗,鄭君芙,黃文政.單側(cè)腎切除SIZ 誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠動物模型研究[J].中國中醫(yī)急癥,2012,15(6):643-645.

〔3〕干正琦.2 型糖尿病腎病與血脂的相關(guān)性分析[J].遼寧實用糖尿病雜志,2004,12(2):27-28.

〔4〕Whiteside CI,Dlugosz JA.Mesangial cell proteein kinas Cisozyme activation in the diabetic milieu[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,282(6):975-980.

〔5〕Koya D,King GL.Protein kinase C activation and the development of diabetic complications[J].Diabetes,2008,4(6):859-866.

〔6〕Grewal JS, Mukhin YV, Garnovskaya MN, et al.Serotonin 5-HT2A receptor induces TGFβ1expression in mesangial cells via ERK:proliferative and fibrotic signals[J].Am J Physiol,1999,276(6 Pt 2):922-930.

〔7〕王郁金,蘇衍進(jìn),馬居里,等,益氣活血方對早期DN 大鼠腎臟PKC、TGF-β1 及血清Chol、TG的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2014,34(1):78-79.

〔8〕李陽.糖尿病腎病的發(fā)病機制及治療進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2010,16(26):18-20.

〔9〕王郁金,蘇衍進(jìn),馬居里,等.自擬益氣活血方對早期糖尿病腎病大鼠腎臟PKC AGEs 及TGFβ1 表達(dá)的實驗研究[J].四川中醫(yī),2014,32(4):68-69.

〔10〕正華,范麗,應(yīng)小平,等.通絡(luò)益腎湯對DN 模型大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的影響[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,33(3):58-61.