李成義，楊苗苗，張櫻山，陸國(guó)弟

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2甘肅奇正藏藥有限公司

甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量分析*

李成義1，楊苗苗1，張櫻山2，陸國(guó)弟1

1甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2甘肅奇正藏藥有限公司

目的：建立板藍(lán)根中多糖的含量測(cè)定方法，分析比較甘肅省內(nèi)不同種植區(qū)域的板藍(lán)根多糖含量差異。方法：采用水提醇沉法提取板藍(lán)根中多糖，利用苯酚-硫酸法測(cè)定板藍(lán)根中多糖的含量。結(jié)果：甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量相差較大，最高為16.22%，最低為10.59%，平均回收率為99.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.15%（n=6）。結(jié)論：該測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、真實(shí)，可用于測(cè)定板藍(lán)根中多糖含量。整體看甘肅地區(qū)板藍(lán)根中多糖含量相對(duì)較低，且不同市縣及鄉(xiāng)鎮(zhèn)其多糖含量存在較大差異，有必要對(duì)其種植區(qū)域進(jìn)行科學(xué)合理規(guī)劃。

板藍(lán)根；多糖；含量測(cè)定

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica For t.的干燥根，性寒味苦，具有清熱解毒，涼血利咽之功效，常用于溫毒發(fā)斑、舌絳紫暗、大頭瘟疫、痄腮、爛喉丹痧、丹毒、癇腫等癥［1］。全國(guó)各地均有分布，現(xiàn)主要產(chǎn)于安徽、河北、甘肅、黑龍江等地。板藍(lán)根中含有較豐富的化學(xué)成分［2-3］，其中多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖，護(hù)肝等多重功效。近年來(lái)隨著板藍(lán)根藥材種植區(qū)域的逐年擴(kuò)增，一些地區(qū)不合理開(kāi)發(fā)板藍(lán)根種植區(qū)域的行為比比皆是，使得人們對(duì)板藍(lán)根藥材的質(zhì)量與療效提出了質(zhì)疑。為此，筆者采集甘肅省內(nèi)20個(gè)不同種植區(qū)域的板藍(lán)根藥材，采用苯酚-硫酸法對(duì)其多糖含量進(jìn)行分析比較研究，為甘肅地區(qū)優(yōu)選板藍(lán)根藥材種植區(qū)域提供科學(xué)合理的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器及主要設(shè)備 XS205DU型梅特勒-托利多分析天平 (梅特勒-托利多上海有限公司提供)；ACY-2001-U型艾科薄超低元素型超純水機(jī)(重慶伊洋企業(yè)發(fā)展有限公司提供)；HSY2-SP電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠提供)；WFH-201B紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司提供)。

1.2 試藥 D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110833-201205，供含量測(cè)定用)；苯酚，濃硫酸、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、三氯乙酸均為分析純，水為超純水。所有板藍(lán)根(序號(hào)與來(lái)源見(jiàn)表2)藥材樣品均經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院李成義教授鑒定，為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica For t.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗多糖的提取和精制多糖的制備 取經(jīng)破碎的板藍(lán)根生藥200 g，置1 000mL的圓底燒瓶中加80%乙醇過(guò)夜，次日取出回流2小時(shí)，冷卻后濾過(guò)，濾液棄去，濾渣揮干溶劑加適量水，回流提取2次，2 h/次，合并兩次提取液并濃縮至150mL，給濃縮液中加無(wú)水乙醇直至溶液含醇量達(dá)80%，充分?jǐn)嚢韬笥?℃冰箱中靜止過(guò)夜，次日濾過(guò)并將濾渣除醇后冷凍干燥至恒重，即得板藍(lán)根粗多糖。準(zhǔn)確稱取以上制得的板藍(lán)根粗多糖，加蒸餾水200mL，再加氯仿多次萃取，隨后加5.0%三氯乙酸適量除去蛋白質(zhì)［4］，并采用透析袋除去無(wú)機(jī)鹽離子，以活性炭脫色，濾過(guò)，濾液加無(wú)水乙醇使含醇量達(dá)80%，4℃冰箱中靜止過(guò)夜，離心，沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，低溫烘干至恒重，制得精制板藍(lán)根多糖。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品約10mg，精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.106 1mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取板藍(lán)根藥材粉末各0.2 g，精密稱定，置于150mL具塞瓶中，加80%乙醇100mL，回流1小時(shí)，放冷，濾過(guò)，濾渣連同濾紙揮干溶劑一起放入具塞瓶中，再加蒸餾水60mL，加熱回流2小時(shí)，趁熱濾過(guò)，用蒸餾水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移入100mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻即可。

2.4 精制板藍(lán)根多糖的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的板藍(lán)根粗多糖10mg，置于50mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻置于冰箱中備用。

2.5 苯酚試液的配制 取苯酚300 g，加碳酸氫鈉0.15 g和鋁片0.25 g，常壓蒸餾182℃餾分，精密稱取該餾分25 g，定溶于500mL棕色容量瓶中，得5%苯酚溶液，置于冰箱中備用。

2.6 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 分別精密移取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.5mL，均置于20mL的具塞刻度試管中，補(bǔ)水至1.5mL，各加5%苯酚溶液1.5mL，混勻，再分別小心滴加濃硫酸5mL，充分搖勻，至沸水浴中煮沸15分鐘后，迅速冷卻，同上操作制得空白溶液，以空白溶液作參比。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～600 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液均在487 nm處有最大吸收峰，故選擇487 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.2，0.5，0.8，1，1.2 mL，分別置于20 mL的具塞刻度試管中，補(bǔ)水至1.5mL，各加5%苯酚溶液1.5mL，混勻，再分別小心滴加濃硫酸5mL，充分搖勻，至沸水浴中煮沸15分鐘后，迅速冷卻，同上操作制得空白溶液，以空白溶液作參比。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在487 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=43.295X-0.004 3(R=0.999 5)，結(jié)果表明葡萄糖對(duì)照品溶液在0.002 7～0.015 9mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.8 換算因子的測(cè)定 取“2.4”項(xiàng)下精制的多糖儲(chǔ)備液0.5mL，按“2.6”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，平行3份，每份測(cè)定2次，由回歸方程求出板藍(lán)根精制多糖中葡萄糖的濃度，并按公式f=W/CD［公式中W為板藍(lán)根精制多糖的質(zhì)量(mg)，C為多糖溶液中葡萄糖的濃度mg/mL，D為板藍(lán)根多糖的稀釋倍數(shù)］，計(jì)算換算因子f，求得f均值為1.05，RSD為1.81%。

2.9 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制得的葡萄糖對(duì)照品溶液0.5mL，按照“2.6”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，吸光度均值為0.344，RSD為2.21%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材樣品溶液，按照“2.6”項(xiàng)下方法操作，每隔20分鐘測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為1.66%，結(jié)果表明樣品溶液在2小時(shí)內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一產(chǎn)地板藍(lán)根藥材粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下分別制備溶液，測(cè)定其吸光度，結(jié)果多糖含量均值為13.38%，RSD為2.96%，表明重復(fù)性良好。

2.12 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量同一產(chǎn)地板藍(lán)根藥材樣品約0.1 g，精密稱定，平行6份，分別加“2.2”項(xiàng)下制得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.13 樣品測(cè)定 按“2.6”項(xiàng)下方法分別測(cè)定甘肅省20個(gè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材樣品吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，由回歸方程求出各供試品溶液中葡萄糖濃度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2(以干燥品計(jì)算)。

3 討論

多糖作為板藍(lán)根藥材中增強(qiáng)免疫力的主要成分，其本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，在分離純化以及結(jié)構(gòu)測(cè)定上難度很大。本試驗(yàn)結(jié)合前人研究成果，比較了回流提取法與超聲法提取板藍(lán)根多糖的提取效果，結(jié)果回流提取法效率高于超聲法提取法。另外，采用苯酚-硫酸法測(cè)定板藍(lán)根中多糖［5-6］，依次對(duì)水的用量，苯酚溶液用量，硫酸溶液用量，加熱時(shí)間及加熱溫度作了優(yōu)化，得出了測(cè)定板藍(lán)根多糖最佳顯色條件為：板藍(lán)根多糖在水1mL，苯酚溶液1.5mL，硫酸溶液5mL，100℃水浴中加熱15分鐘顯色效果相對(duì)明顯。

表1 板藍(lán)根藥材加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 板藍(lán)根藥材樣品中多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

目前，板藍(lán)根多糖雖還未列入2010版《中國(guó)藥典》必測(cè)成分中，但基于多糖本身所具有的特殊性，無(wú)論是在醫(yī)藥還是保健品方面都有其不可代替的地位，因此研究板藍(lán)根中多糖具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)比較了甘肅不同產(chǎn)地板藍(lán)根中多糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地多糖含量差異較大，其中以張掖市山丹縣位奇鎮(zhèn)十里堡村產(chǎn)的板藍(lán)根多糖含量最高，民樂(lè)縣三堡鎮(zhèn)韓莊村產(chǎn)的多糖含量最低，出現(xiàn)這種含量差異可能與兩地土壤類型、光照時(shí)間、氣溫高低及海拔高低等多條件方面有關(guān)。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道［7］不同產(chǎn)地菘藍(lán)種質(zhì)內(nèi)在品質(zhì)差異除與遺傳因素有關(guān)外，很大程度與其所處環(huán)境密切相關(guān)。這進(jìn)一步說(shuō)明生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)板藍(lán)根藥材內(nèi)在質(zhì)量影響甚大。因此，合理規(guī)劃藥材種植區(qū)域?qū)⒊蔀樗幉钠焚|(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵，本試驗(yàn)將為甘肅地區(qū)合理規(guī)劃板藍(lán)根種植區(qū)域和保證藥材質(zhì)量方面提供借鑒性的資料。

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Determ ination of Polysaccharides in BanLanGen from DifferentHabitatsof Gansu Province

LIChengyi1,YANGMiaomiao1,ZHANG Yingshan2,LU Guodi1
1 Gansu University of Chinesemedicine,Lanzhou 730000,China; 2 Gansu Qizheng Tibetan Pharmaceutical Joint Stock Co.,Ltd

Objective:To distinguish the contentdifferencesof polysaccharides in BanLanGen(isatis tinctoria) from differenthabitats of Gansu Province by establishing a determ inationmethod.Methods:The polysaccharides in the Banlangen were extracted by water-extraction and alcohol-precipitationmethod and the polysaccharide contents were determ ined by phenol-sulfuric acid method.Results:The differences in different regions in Gansu province were great;the highestwas 16.22%,the lowest10.59%,the average recovery rate 99.42%and RSD 1.15%(n=6). Conclusion:The determiningmethod adopted,whichwas simple,accurate and practical,can be used tomeasure the contentof polysaccharides in Banlangen.Wholly,the polysaccharide contents of Banlangen in Gansu province are relatively low;because there exists great differences in the polysaccharide contents of Banlangen from different cities,countiesand towns,a scientific and rationalplanning for Banlangen′s planting division isnecessary.

BanLanGen;polysaccharides;contentdeterm ination

R259

A

1004-6852(2015)02-0005-03

2014-05-05

2013年甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)1308RJZA176)。

李成義(1964—)，男，博士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥品種與質(zhì)量研究。