車佳

水飛薊賓通過降低MEK/ERK途徑依賴的MMP-9蛋白表達(dá)抑制人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

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目的 探討水飛薊賓對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制。方法 用不同濃度水飛薊賓處理人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 24h，采用MTT（噻唑藍(lán)）法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用；采用transwell技術(shù)檢測(cè)水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；Western blot檢測(cè)水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞MEK及ERK（均為絲裂原激活的蛋白激酶）蛋白磷酸化水平及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)水平的影響。結(jié)果 水飛薊賓可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并造成腫瘤細(xì)胞死亡，與對(duì)照組比較，水飛薊賓增殖抑制率［20μM（8.9±3.8）%、50μM（19.7±4.2）%、100μM（29.8±5.7）%比0］、臺(tái)盼藍(lán)染色率［50μM（16.1±4.8）%、100μM（25.3±5.1）%比（3.4±1.4）%］，均升高（P＜0.05，P＜0.01）；水飛薊賓通過抑制MEK（水飛薊賓20μM：0.26±0.03、50μM：0.15±0.03、100μM：0.11±0.02比對(duì)照組：0.35±0.04）和ERK（水飛薊賓20μM：0.23±0.03、50μM：0.12±0.02、100μM：0.07±0.01比對(duì)照組：0.32±0.05）的磷酸化降低MMP-9（水飛薊賓50μM：0.18±0.03、100μM：0.14±0.02比對(duì)照組：0.29±0.04）的表達(dá)并抑制MCF-7［水飛薊賓20μM：（14.3±2.1）%、50μM：（35.6± 5.7）%、100μM（53.1±6.5）%比對(duì)照組：0］細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 水飛薊賓抑制人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。

乳腺癌；水飛薊賓；MEK/ERK；MMP-9；腫瘤侵襲

水飛薊賓是水飛薊素中最主要的生物活性成分，來源于水飛薊屬植物奶薊種子的提取物，臨床上主要用于保護(hù)肝細(xì)胞，對(duì)肝炎、膽囊疾病有良好的療效，具有高效、低毒、低副作用的特性[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[2]，研究人員還發(fā)現(xiàn)水飛薊賓治療能推遲Her2/neu（一種原癌基因）轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性乳腺癌的發(fā)生并減小腫瘤的體積和質(zhì)量[3]。乳腺癌的發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌，而在女性群體中是發(fā)生率最高的惡性腫瘤，它的高轉(zhuǎn)移性使之目前仍無法治愈[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種明膠酶，能降解腫瘤附近組織基底膜的Ⅳ型膠原，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]，乳腺癌患者血清MMP-9水平如果顯著升高往往預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡化[6]。本研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，更重要的是，水飛薊賓還能通過抑制MMP-9的表達(dá)抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來自于ATCC（American type culture collection，美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所）。細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640（roswell park memorial institute-1640）培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，加入100U/L青霉素和100mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；水飛薊賓、二甲亞砜、MTT、臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；β-actin、MMP-9、p-MEK（磷酸化MEK）、p-ERK（磷酸化ERK）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signal公司；transwell小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司。

1.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基調(diào)成5×104個(gè)/mL濃度，取200μL接種于96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，治療組分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對(duì)照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h，加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL二甲亞砜，在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD（吸光度）值，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組OD值-治療組OD值）/對(duì)照組OD值× 100%。

1.4 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞殺傷活性試驗(yàn) 在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入 10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對(duì)照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h，用臺(tái)盼藍(lán)染死細(xì)胞，低倍鏡下計(jì)數(shù)受染細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值即為水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷率。

1.5 Western blot試驗(yàn) 在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)2h，對(duì)照組不加水飛薊賓培養(yǎng)2h，之后將細(xì)胞裂解后做Western blot檢測(cè)磷酸化MEK和磷酸化ERK的含量，MMP-9蛋白表達(dá)水平需在上述培養(yǎng)體系中用水飛薊賓培養(yǎng)24h再用Western blot檢測(cè)，各蛋白表達(dá)量由它們?cè)谀z片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin的灰度比表示。

1.6 腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移試驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞懸液用無血清培養(yǎng)基調(diào)成2×104個(gè)/mL濃度，取500μL接種于transwell小室（即上室）中置于普通24孔板上，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在上室中分別加入10、20、50和100μM的水飛薊賓培養(yǎng)24h，對(duì)照組不加水飛薊賓培養(yǎng)24h。普通24孔板（即下室）中培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640。培養(yǎng)24h后取出transwell小室，用磷酸鹽緩沖液（PH7.4）洗去小室內(nèi)的細(xì)胞，將transwell膜用3%多聚甲醛固定15min后用0.1%結(jié)晶紫染色20min，低倍鏡（100×）觀察4個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，膜上細(xì)胞數(shù)越多表明腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，P值計(jì)算采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用 在水飛薊賓作用下實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組均呈現(xiàn)劑量依賴性抑制效應(yīng)（P＜0.05），證實(shí)了水飛薊賓有體外抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的生物活性。臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著水飛薊賓濃度的增加，MCF-7細(xì)胞染色率隨之增加，表明水飛薊賓有體外殺傷乳腺癌細(xì)胞的生物活性，見表1。

表1 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

對(duì)照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組33333 0 10 20 50 100 0 3.9±1.9 8.9±3.8* 19.7±4.2* 29.8±5.7** 3.5±1.4 5.2±2.6 9.4±3.1 16.1±4.8* 25.3±5.1**

2.2 水飛薊賓抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移 隨著水飛薊賓劑量的增加，transwell膜上的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），且水飛薊賓對(duì)MCF-7的侵襲力的抑制率顯著高于同濃度下水飛薊賓對(duì)MCF-7的增殖抑制率（增殖抑制率為表1數(shù)據(jù)）（P＜0.05，P＜0.01）。證實(shí)水飛薊賓不僅能直接抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)也能顯著抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，見表2。

表2 水飛薊賓對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲力的影響（±s）

表2 水飛薊賓對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲力的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同濃度水飛薊賓治療后的增殖抑制率比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別對(duì)照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組孔數(shù)33333水飛薊賓濃度（μM）0 10 20 50 100細(xì)胞個(gè)數(shù)（個(gè)）305.4±33.8 288.6±46.7 261.5±38.3* 196.9±31.3** 143.6±18.1**侵襲抑制率（%）0 5.6±0.9 14.3±2.1* 35.6±5.7**△53.1±6.5**△△增殖抑制率（%）0 3.9±1.9 8.9±3.8* 19.7±4.2* 29.8±5.7**

表3 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達(dá)水平的影響（±s）

表3 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達(dá)水平的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；p-MEK：磷酸化MEK；p-ERK：磷酸化ERK

組別對(duì)照組10μM水飛薊賓組20μM水飛薊賓組50μM水飛薊賓組100μM水飛薊賓組孔數(shù)33333水飛薊賓濃度（μM）0 10 20 50 100灰度比（MMP-9/β-actin）0.29±0.04 0.28±0.05 0.24±0.04 0.18±0.03* 0.14±0.02**灰度比（p-MEK/β-actin）0.35±0.04 0.30±0.04 0.26±0.03* 0.15±0.03* 0.11±0.02**灰度比（p-ERK/β-actin）0.32±0.05 0.29±0.05 0.23±0.03* 0.12±0.02** 0.07±0.01**

2.3 水飛薊賓對(duì)MCF-7細(xì)胞MEK及ERK蛋白磷酸化水平及MMP-9表達(dá)水平的影響 水飛薊賓能有效抑制MEK和ERK的磷酸化，從而使其下游的MMP-9蛋白表達(dá)受到抑制（P＜0.05，P＜0.01），減弱MCF-7細(xì)胞的侵襲力，見表3。

3 討論

乳腺癌的高度轉(zhuǎn)移性是乳腺癌難治及死亡率高的重要原因，腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境下會(huì)向營(yíng)養(yǎng)充足的組織侵襲遷移[7]。在這一過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）起著至關(guān)重要的作用，MMPs已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，而MMP-9是MMPs中的重要成員，有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)MMP-9表達(dá)顯著增加時(shí)腫瘤的侵襲力增強(qiáng)，反之當(dāng)MMP-9表達(dá)受抑制時(shí)腫瘤細(xì)胞的侵襲力減弱[8-9]。MMP-9基因的啟動(dòng)子序列包含兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，即AP-1（activator protein-1，激活子蛋白-1）和NF-κB[10]（nuclear factor-κB，核因子-κB）。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合依賴于ERK蛋白激酶的激活，Raf/ MEK/ERK信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)是AP-1和NF-κB活化的重要途徑[11-12]。本研究結(jié)果提示水飛薊賓可以通過阻斷這條信號(hào)通路抑制AP-1和NF-κB的活化從而抑制它們與MMP9基因啟動(dòng)子的結(jié)合，這可能是水飛薊賓抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。水飛薊賓近些年來被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)于多種腫瘤均具有良好抑制作用[13-14]，是一種非常高效且低毒低副作用的天然藥物。本研究不但證實(shí)水飛薊賓具有很好的抗乳腺癌細(xì)胞增殖的活性，而且還提示了它能有效減弱乳腺癌對(duì)周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移，為水飛薊賓的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)和前景。

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（收稿：2014-08-10 修回：2014-10-31）

Silibinin Inhibits M etastasis and Invasion of Breast Cancer Cells Via Decreasing the Expression of MMP-9 Dependent on MEK/ERK Pathway

CHE Jia. Clinical Laboratory,Zhejiang Provincial Tongde Hopsital, Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of silibinin on proliferation and invasion of breast cancer cells and the underlying mechanism.M ethods Human breast cancer cell line MCF-7 were treated with various concentrations of silibinin for 24h,then MTT assay was used to detect cell proliferation.The effect of silibinin on invasion of MCF-7 cells was measured by transwell.The phosphorylation of MEK and ERK proteins and the expression of MM-9 protein were evaluated by western blot.Results The inhibitory rate of silibinin on MCF-7 cell proliferation was（8.9±3.8）%at 20μM,（19.7±4.2）%at 50μM,and（29.8±5.7）%at 100μM,with significant difference compared with control group（P＜0.05）.Typan blue staining rate of MCF-7 cells treated with silibinin at concentration of 50 and 100μM was（16.1±4.8）%and（25.3±5.1）%,respectively,both with significant difference compared with that of control group[（3.4±1.4）%,P＜0.05].Silibinin at concentration of 20,50,and 100μM inhibited the phosphorylation of MEK（0.26±0.03,0.15±0.03,0.11±0.02 vs 0.35±0.04）and ERK（0.23±0.03,0.12±0.02,0.07±0.01 vs 0.32±0.05）proteins.Silibinin of 50 and 100μM decreased the expression of MMP-9 protein（0.18±0.03,0.14±0.02 vs 0.29±0.04）.Silibinin inhibited metastasis and invasion of MCF-7 cells[20μM：（14.3±2.1%）,50μM：（35.6±5.7）%, 100μM：（53.1±6.5）%vs 0].Conclusion Silibinin can inhibit the growth and invasion of breast cancer cells.

Breat cancer;Silibinin;MEK/ERK;MMP-9;Tumor invasion

浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310012）