王秀秀 楊明華 李 昌 匡海鷗 和紹禹 李亞輝

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

東方蜜蜂卵黃原蛋白基因cDNA克隆及其基本生物信息學(xué)特征

王秀秀1*楊明華1，2*李 昌3匡海鷗3和紹禹3李亞輝3

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

卵黃原蛋白（vitellogenin,Vg）基因在蜜蜂的卵巢發(fā)育、胚胎營養(yǎng)、勞動分工、行為調(diào)控、氣候適應(yīng)、壽命延長等方面起著重要作用，但東方蜜蜂中該基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)卻鮮有報道。本研究對東方蜜蜂Vg基因的cDNA全長序列進(jìn)行了克隆、測序和基本的生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列為5313bp，提交到GenBank的登錄號為KP119837，該基因共編碼1770個氨基酸，其cDNA和所編碼的氨基酸序列與意大利蜜蜂的同源性分別為93%和89%，其保守區(qū)序列占全序列的63%。基于Vg基因?qū)γ鄯鋵賰?nèi)序列已知的4種蜜蜂構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：東方蜜蜂與意大利蜜蜂的親緣關(guān)系最近，與大蜜蜂的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，與小蜜蜂的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。本論文為進(jìn)一步研究東方蜜蜂Vg基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

東方蜜蜂，卵黃原蛋白，Vg,cDNA，克隆，生物信息學(xué)

卵黃原蛋白（vitellogenin,Vg）普遍存在于卵生雌性動物的卵黃前體中，是一個專門結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)母體資源（如脂質(zhì)、碳水化合物、金屬離子和磷）供應(yīng)卵母細(xì)胞的磷酸糖脂蛋白[1]。卵黃原蛋白前體在卵巢外脂肪體組織，經(jīng)雌雄特異性和階段特異性地合成，后被分泌到血淋巴，最后被卵母細(xì)胞通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取[2～4]。在脂肪體中，Vg分子被蛋白酶水解后，再經(jīng)翻譯后修飾以協(xié)助將碳水化合物、脂質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢。被卵母細(xì)胞吸收后，Vg以結(jié)晶形式的卵黃蛋白（（vitellin,Vn或yolk protein,YP））貯存起來，作為未來胚胎的營養(yǎng)來源[2,5～7]。

在昆蟲中，卵黃原蛋白最早在惜古比天蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時被稱作雌性特異性蛋白，Tefler證明其參與卵黃的形成[8]。1969年，Pan等人確定了脂肪體是該蛋白的主要合成部位，并將其命名為Vg，作為卵黃蛋白的前體[9]。之后的研究表明，在其他昆蟲中，雌性個體的脂肪體是Vg生物合成的主要部位[10,11]。但這并不意味著Vg只能在脂肪體中合成，例如，環(huán)裂亞目的卵巢濾泡上皮細(xì)胞也產(chǎn)生Vg[12-14]。值得一提的是：一些物種的雄性動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有Vg存在（盡管量很少），因此，Vg不再被認(rèn)為具有雌性特異性[15～18]。

蜜蜂只能在脂肪體中合成Vg，其分子量為180 kDa[19]。大多數(shù)物種只在具有生殖能力的雌性中合成Vg，而在蜜蜂中，Vg在繁殖力很強(qiáng)的蜂王體內(nèi)，雄蜂體內(nèi)以及不具有生殖能力的工蜂體內(nèi)均能表達(dá)[20]。Vg是由工蜂的咽下腺產(chǎn)生的，作為蜂王漿的一部分（是蜂王漿的氨基酸來源）被飼喂給蜂王，為蜂王和發(fā)育中的幼蟲提供營養(yǎng)[21]。國外的研究發(fā)現(xiàn)，Vg在蜜蜂中還有多種調(diào)節(jié)功能：（1）Vg抑制工蜂從巢內(nèi)工作向采集工作轉(zhuǎn)變[22]；（2）Vg影響工蜂的采集偏好，血淋巴中Vg水平低的年輕工蜂偏愛采集花蜜，而Vg水平較高的工蜂則偏愛采集花粉[23]；（3）Vg可以通過清除自由基，減少氧化應(yīng)激，從而延長工蜂和蜂王的壽命[24,25]。此外，Vg還與蜜蜂的氣候適應(yīng)，生殖競爭相關(guān)[26,27]。

但有關(guān)東方蜜蜂Vg基因研究的報道極少，本論文以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)手段，對東方蜜蜂的Vg基因進(jìn)行了克隆、測序和基本的生物信息學(xué)分析，本研究為解讀蜜蜂功能基因Vg，深入研究東方蜜蜂Vg基因的作用與功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的東方蜜蜂由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所提供。

1.2 卵黃原蛋白基因的cDNA擴(kuò)增

取東方蜜蜂的腹部，根據(jù)TRNzol-A+總RNA提取試劑盒(TIANGEN)的操作說明提取總RNA，根據(jù)NCBI中已發(fā)表的意大利蜂的mRNA序列分三段設(shè)計(jì)引物(FF:5'CATGTTGCTACTTCTAACGCTT 3'；FR:5' GTTTGGGTAATGGCATCTCT 3'；SF:5'ACCGAACGATAAATCTCAGG 3' ；SR: 5' CATCTTCGGCTTCTGGTC 3'；TF:5' GGAAACTCTTCTGTCCTACG 3'；TR:5'CTTTCGAGTTAAGCCTTGC 3')，按照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒 (TIANGEN)合成cDNA第一鏈。

使用Taq Polymerase(TIANGEN)和Long Taq Polymerase(TIANGEN)分別對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 cDNA的克隆與測序

使用普通瓊脂糖DNA回收試劑盒(TIANGEN)純化目的基因PCR產(chǎn)物，然后用零背景快速連接試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取重組克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，最后將陽性克隆送到英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.4 卵黃原蛋白基因的生物信息學(xué)分析

使用SeqMan對得到的測序結(jié)果進(jìn)行校正和拼接得到Vg基因cDNA全長序列。然后將處理后的序列分別應(yīng)用Blastn檢索程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和開放閱讀框（ORF）查找程序（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf）在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列同源性檢索分析與開放閱讀框識別。同時，將所得序列用EditSeq翻譯成氨基酸。最后將所得到的Vg基因cDNA全長序列及其編碼的氨基酸序列通過Banklt提交程序提交到GenBank。

將東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列與在Gen－Bank檢索到的已提交的同源性序列在MEGA中進(jìn)行Alignment計(jì)算后再用Gblock 0.91軟件（在線服務(wù)器：http://www.phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/one_task.cgi

task_type=gblocks）進(jìn)行保守區(qū)序列選擇后，最后用MEGA和MrBayes件用ML（最大似然法），MP（最大簡約法）和BI（貝葉斯法）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 東方蜜蜂卵黃原蛋白基因cDNA全長序列克隆

東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列為5313bp，提交到GenBank的登錄號為KP119837，A、G、T、C的堿基數(shù)分別為1549、1337、1124、1303個，各占總堿基數(shù)的29.5%、25.16%、21.16%和24.52%。

2.2 基因序列的開放閱讀框，編碼氨基酸及保守區(qū)分析

開放閱讀框（ORF）查找程序（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf）分析東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列有一個完整的開放閱讀框。EditSeq分析其共編碼1770個氨基酸，其理論等電點(diǎn)和相對分子量分別為6.612和201.23KD。使用Gblock 0.91軟件分析其保守區(qū)序列占總序列的63%。

2.3 Vg基因系統(tǒng)發(fā)育分析

應(yīng)用Blastn檢索程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank數(shù)據(jù)庫中將東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與意大利蜜蜂Vg基因cDNA全長序列的相似性達(dá)到93%，其各自編碼的氨基酸序列的相似性達(dá)到89%。東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列與大蜜蜂、小蜜蜂類似卵黃原蛋白基因（Vg-like）cDNA全長序列的相似性分別為 93%與90%，其編碼氨基酸序列相似性分別達(dá)到90%與87%。

將克隆出的東方蜜蜂的Vg基因與GenBank上已發(fā)表的相關(guān)物種的Vg基因進(jìn)行核苷酸序列比對，用Gblock 0.91軟件選擇保守區(qū)序列選擇后，用ML法、MP法和BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如下圖：

ML、MP和BI三種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

用三種方法（樹上各分支的數(shù)據(jù)分別代表三種方法，ML、MP、BI）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看出，三種方法得到的結(jié)果一致，且置信度都很高，說明得到的結(jié)果非?？煽?。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，在蜜蜂屬內(nèi)，東方蜜蜂與意大利蜂的親緣關(guān)系最近，與大蜜蜂親緣關(guān)系次之，與小蜜蜂的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。東方蜜蜂作為蜜蜂屬內(nèi)的物種，與熊蜂屬內(nèi)的紅光熊蜂、曉峰熊蜂關(guān)系較近，與壁蜂屬內(nèi)的角額壁蜂親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

對Vg基因的研究始于1954年[8]，由于其重要作用，被西方學(xué)者所重視。他們對昆蟲中非蜜蜂科的天蠶、柞蠶、美國小蠊、淺色按蚊、米蛾，蜜蜂科內(nèi)的意大利蜜蜂、普通熊蜂、苜蓿切葉蜂、角額壁蜂、麗蚜小蜂的Vg基因cDNA不僅進(jìn)行了克隆，其表達(dá)特性的研究亦很深入，它的功能也得到了驗(yàn)證。在我國，從報道資料來看，目前對Vg基因的研究只限于棉鈴蟲、大草蛉、七星瓢蟲及幾種常見的寄生蜂[28～31]。Li et al.和李繼蓮等人分別于2010年和2012年成功克隆出曉峰熊蜂、紅光熊蜂Vg基因cDNA全長序列[32,33]，填補(bǔ)了國內(nèi)對蜜蜂科內(nèi)物種Vg基因克隆工作的空白。有關(guān)東方蜜蜂Vg基因的研究，目前僅見于2012年李志勇等人對東方蜜蜂不同日齡成蜂個體中卵黃原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄模式的研究[34]。本研究以東方蜜蜂總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)首次克隆了東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列，為今后進(jìn)一步研究東方蜜蜂Vg的結(jié)構(gòu)，Vg基因的功能和表達(dá)調(diào)控等奠定了基礎(chǔ)。

東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列為5313bp，編碼1770個氨基酸，序列分析發(fā)現(xiàn)其與GenBank中已提交的意大利蜜蜂Vg基因cDNA全長序列，發(fā)現(xiàn)其編碼的開放閱讀框數(shù)量以及編碼的氨基酸數(shù)量相同[35]。其E值與意大利蜜蜂最小，表明其序列與意大利蜜蜂的同源性最高。而根據(jù)ML、MP和ML三種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，東方蜜蜂與意大利蜜蜂位于同一分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)果與在Genbank中Blast的結(jié)果一致。

根據(jù)NCBI在線BLAST的結(jié)果，東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列與大蜜蜂、小蜜蜂類似Vg基因cDNA全長序列的相似性分別為93%與90%，結(jié)合三種方法進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析，我們推測：由美國貝勒醫(yī)學(xué)院小蜜蜂全基因測序小組于2012年3月提交的小蜜蜂類似Vg基因的序列就是小蜜蜂的Vg基因的序列；2014年1月由美國冷泉港大蜜蜂全基因組測序?qū)嶒?yàn)室向GenBank提交的大蜜蜂類似Vg基因的序列就是大蜜蜂的Vg基因序列。

由系統(tǒng)發(fā)育分析本研究得出，蜜蜂科內(nèi)東方蜜蜂、意大利蜂、大蜜蜂、小蜜蜂作為蜜蜂屬內(nèi)的物種，與熊蜂屬的關(guān)系較近，與壁蜂屬中的角額壁蜂的親緣關(guān)系次之。Vg基因參與胚胎營養(yǎng)，巢內(nèi)工作向采集工作的轉(zhuǎn)變以及對花粉與花蜜的采集偏好，上述蜂種在以上方面存在的差異是否與Vg基因相關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，本研究首次克隆了東方蜜蜂Vg基因（據(jù)我們所知，這是迄今為止第一次報道的東方蜜蜂Vg基因cDNA全長序列，該基因的cDNA全長序列也已提交到GenBank），并對該基因進(jìn)行了基本的生物信息學(xué)分析。但我們的研究還不夠深入，許多問題有待解決，如Vg基因在東方蜜蜂中的表達(dá)情況，對行為有何調(diào)控作用等還有待于進(jìn)一步研究。弄清Vg基因在東方蜜蜂體內(nèi)所起的作用，將對保護(hù)我國這一寶貴蜂種產(chǎn)生積極的作用。

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Cloning and fundamental bioinformatical characteristics of Vitellogenin cDNA in honeybees Apis cerana

Wang Xiuxiu1*,Yang Minghua1,2*,Li Chang3,Kuang Haiou3He Shaoyu3,Li Yahui3
（1.College of Animal Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;2.Yunnan Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;3.College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201）

Vitellogenin (Vg)gene plays a pivotal role in ovarian development,embryotrophy,labor division,behavior regulation,climate adaptation and life extending.However,the fundamental data of Vg gene in Eastern honeybees (Apis cerana)has rarely been reported.In the present study,the full-length cDNA of Vg in Apis cerana was cloned,sequenced and analyzed bioinformatically.The results indicate that:the full-length cDNA of Vg in Apis cerana was composed of 5313bp which encode 1770 amino acids.The Vg cDNA sequence of Apis cerana was presented to GenBank with the accession number of KP119837.The sequence identity of the Vg cDNA and the encoding amino acid for Apis cerana and Apis mellifera were 93%and 89%,respectively.The conserved cDNA sequence accounted for 63%in the whole sequence.Phylogenetic tree of Vg was constructed with 4 honeybee species in Apis genus whose Vg sequences are known.The genetic relationship analysis showed that Apis cerana is genetically closest to Apis mellifera,while it is further and furthest to Apis dorsata and Apis florea,respectively.This study will lay a foundation for the further study of Vg function in Apis cerana.

Apis cerana,vitellogenin,Vg,cDNA,cloning,bioinformatics.

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜜蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-45-kxj14）。

*對本研究貢獻(xiàn)等同，并列第一作者。王秀秀（1989-），女，河南人，在讀碩士，從事蜜蜂分子生物學(xué)研究，E-mail：cera0393@163. com；楊明華（1967-），女，云南人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控研究，E-mail：yangmh85@hotmail.com.

和紹禹（1952-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事蜜蜂資源與授粉研究，E-mail：kmhsy@163.com；李亞輝（1967-），男，博士，教授，從事動物生殖與發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：kmliyh@163.com.