孔福全，馬南茹，隋 麗，＊，王 瀟，劉曉丹，張小玲，劉建成，周平坤，＊

（1.中國原子能科學(xué)研究院 核物理研究所，北京 102413；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

質(zhì)子誘導(dǎo)AHH-1細(xì)胞PIG3基因的mRNA表達(dá)和細(xì)胞周期改變研究

孔福全1，馬南茹1，隋 麗1，＊，王 瀟1，劉曉丹2，張小玲1，劉建成1，周平坤2，＊

（1.中國原子能科學(xué)研究院 核物理研究所，北京 102413；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

本文利用串列加速器加速的21MeV的質(zhì)子束流對(duì)人正常淋巴細(xì)胞AHH-1進(jìn)行輻照，研究了質(zhì)子誘導(dǎo)AHH-1細(xì)胞PIG3基因的mRNA表達(dá)量和細(xì)胞周期改變的劑量和時(shí)間相關(guān)性。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)果顯示，質(zhì)子輻照后，PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨劑量的增大而增大，表現(xiàn)出很好的劑量相關(guān)性。在不同的劑量點(diǎn)下，表達(dá)量隨時(shí)間的變化趨勢也大致相似，峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)除8Gy劑量點(diǎn)出現(xiàn)在12h外，其他劑量點(diǎn)均在照后6h達(dá)到。理論擬合曲線和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)出很好的一致性。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，在每個(gè)劑量點(diǎn)下，G2／M期細(xì)胞隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。以上結(jié)果說明PIG3基因mRNA的表達(dá)量在生物劑量計(jì)的應(yīng)用上可能具有一定的基礎(chǔ)和潛力，值得進(jìn)一步研究。

質(zhì)子；PIG3基因；劑量；生物劑量計(jì)

核能的普及應(yīng)用、核武器等戰(zhàn)略核力量的存在以及載人航天飛行的快速發(fā)展，使人類面臨核與空間輻射的威脅大幅增加。第一時(shí)間獲得人員的受照劑量，評(píng)估輻射對(duì)人體造成的危害是實(shí)施正確救治措施的基礎(chǔ)。劑量儀、探測器等物理劑量測量方法可給出精確的劑量值。但面臨突然發(fā)生、無法預(yù)料的核事故或核恐怖襲擊時(shí)，物理劑量可能不能及時(shí)得到，這時(shí)生物劑量計(jì)就展現(xiàn)出了物理劑量計(jì)所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。近年來國內(nèi)外已得到應(yīng)用或正在研究的生物劑量估計(jì)方法有多種，但各種方法均有其局限性［1－3］。

Polyak等［4］、龍賢輝等［5－6］研究了人淋巴母細(xì)胞AHH-1輻照后基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)PIG3（p53誘導(dǎo)的基因3）基因起到了一定的作用［7］。劉曉丹等［8］進(jìn)行了γ輻射誘導(dǎo)淋巴母細(xì)胞AHH-1中PIG3表達(dá)的劑量相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)PIG3基因mRNA的表達(dá)水平與劑量和時(shí)間具有一定的效應(yīng)關(guān)系。潘艷等［9］進(jìn)行了γ輻射誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞32F中PIG3基因mRNA表達(dá)的劑量相關(guān)性研究，也發(fā)現(xiàn)了表達(dá)量與劑量和時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系。另有研究［10］表明，受0.05～0.2Gy的γ射線誘導(dǎo)后，AHH-1細(xì)胞的PIG3基因mRNA的表達(dá)量有所升高，并且PIG3基因mRNA的表達(dá)量與輻照劑量呈一元二次關(guān)系。

本文擬采用質(zhì)子束流對(duì)人類正常淋巴母細(xì)胞AHH-1進(jìn)行輻照，研究質(zhì)子誘導(dǎo)AHH-1細(xì)胞PIG3基因mRNA的表達(dá)量與輻照劑量之間的關(guān)系，以及其隨時(shí)間的變化。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；新生胎牛血清，美國Hyclone公司；TRNzol-A＋總RNA提取試劑，天根生化科技（北京）有限公司；GoldScript cDNA合成試劑盒，美國Invitrogen公司；Quantscript RT Kit Quant cDNA第1鏈合成試劑盒（KR103），天根生化科技（北京）有限公司；Real Master Mix（SYBR Green，F(xiàn)P202），天根生化科技（北京）有限公司；Chromo4實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì)（由外單位檢測），德國Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀，美國Becrman Coulter公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及照射

所用細(xì)胞為人類正常淋巴母細(xì)胞AHH-1，源自人類外周血B淋巴細(xì)胞，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)送。AHH-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，以RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)加10%的新生胎牛血清。培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2／95%空氣、100%相對(duì)濕度下生長。培養(yǎng)至指數(shù)生長期，以備照射。

1.3 質(zhì)子輻照實(shí)驗(yàn)

輻照前離心收集指數(shù)生長期的淋巴母細(xì)胞AHH-1，用少量培養(yǎng)基吹打均勻并分裝于200μL微量離心試管（EP管）中，用中國原子能科學(xué)研究院HI-13串列加速器的Q3D磁譜儀進(jìn)行質(zhì)子輻照，加速器產(chǎn)生的質(zhì)子能量為22MeV，經(jīng)過100μm的膜窗、300μm的鋁箔及50cm的空氣后，質(zhì)子能量下降到約21MeV。

樣品輻照時(shí)將EP管固定于樣品板并置于正對(duì)束流中心位置處，面向質(zhì)子出射窗口進(jìn)行照射。通過多次重復(fù)測量，得到樣品點(diǎn)質(zhì)子注量與監(jiān)測點(diǎn)質(zhì)子注量的比值。由式（1）計(jì)算21MeV質(zhì)子在水中的輻照劑量與注量的轉(zhuǎn)換關(guān)系：

D＝1.6×10－9×LET×F／ρ（1）式中：D為劑量，Gy；LET為傳能線密度，keV／μm；F為離子注量，cm－2；ρ為粒子通過的物質(zhì)的密度，g／cm3。

利用SRIM程序模擬計(jì)算得到21MeV質(zhì)子在水中的LET為2.5keV／μm，由式（1）計(jì)算得到產(chǎn)生1Gy劑量所需的質(zhì)子注量為2.5× 108cm－2，實(shí)現(xiàn)2、6、8Gy吸收劑量分別需要1×109、3×109、4×109cm－2的質(zhì)子注量。

質(zhì)子輻照后收集細(xì)胞，更換新的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于質(zhì)子輻照后的6、12、24、48h離心收集細(xì)胞；除去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次；再用1mL PBS緩沖液重懸細(xì)胞。取0.9mL重懸細(xì)胞用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定PIG3基因mRNA的表達(dá)水平，0.1mL用于流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期的檢測。

1.4 PIG3基因mRNA的表達(dá)量檢測

1）細(xì)胞總RNA提取

在輻照后指定時(shí)間離心收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入適量Trnzol，充分裂解后于－20℃臨時(shí)保存。收集完成后統(tǒng)一按試劑說明書提取總RNA，準(zhǔn)確定量后于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）cDNA合成

所有實(shí)驗(yàn)組均取2μg等量的總RNA，用Quantscript RT Kit Quant cDNA第1鏈合成試劑盒（KR103）進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄合成。反轉(zhuǎn)錄合成體系的體積為20μL，具體操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

3）實(shí)時(shí)定量PCR

反轉(zhuǎn)錄用Bio-Rad公司的Chromo4實(shí)時(shí)熒光PCR儀，按照用戶手冊操作。PCR試劑采用Real Master Mix，采用的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物是依據(jù)Cenebank數(shù)據(jù)庫中PIG3和β-肌動(dòng)蛋白的基因序列所設(shè)計(jì)合成的，PIG3和β-肌動(dòng)蛋白引物序列及PCR條件列于表1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)各取1μL的第1鏈cDNA合成產(chǎn)物，在20μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均以β-肌動(dòng)蛋白為對(duì)照。每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)循環(huán)樣。在每次實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線分析，以排除引物二聚體的影響。

表1 PCR引物序列和PCR條件Table 1 PCR primer sequence and PCR condition

4）PCR檢測數(shù)據(jù)分析

以β-肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參基因，用比較循環(huán)閾值Ct（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）的方法相對(duì)定量PIG3基因mRNA的表達(dá)水平，即以0Gy照射的AHH-1細(xì)胞中PIG3基因mRNA的表達(dá)量為1，其他樣品中PIG3基因mRNA的表達(dá)量均為標(biāo)準(zhǔn)樣品的n倍，依據(jù)式（2）計(jì)算PIG3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量RQ：

其中，ΔΔCt為目的基因的Ct與內(nèi)參基因的Ct的差值。

5）細(xì)胞周期測定

于照后不同時(shí)間收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，加預(yù)冷的75%乙醇固定24h以上；檢測前離心除去固定液，加RNA酶，于37℃水浴30min；再次離心除去RNA酶，加溴化乙錠（PI）室溫染色30min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 質(zhì)子誘導(dǎo)AHH-1細(xì)胞PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨劑量和時(shí)間的變化

圖1為經(jīng)質(zhì)子輻照后6、12、24、48h，淋巴母細(xì)胞AHH-1的PIG3基因mRNA的表達(dá)量與質(zhì)子劑量的關(guān)系及擬合曲線。由圖1可見，在質(zhì)子輻照后的6、12、24、48h，AHH-1細(xì)胞PIG3基因mRNA的表達(dá)水平均隨劑量的增加而增大，0、2、6、8Gy劑量點(diǎn)間保持了劑量-效應(yīng)的二次關(guān)系。但因8Gy劑量點(diǎn)PIG3基因mRNA的表達(dá)量在照后12h達(dá)到峰值，而2Gy和6Gy劑量點(diǎn)PIG3基因mRNA的表達(dá)量在照后12h已下降，故在12h點(diǎn)PIG3基因mRNA的表達(dá)量與輻照劑量關(guān)系的二次擬合表現(xiàn)相對(duì)較差。在質(zhì)子輻照后的24h，各劑量點(diǎn)PIG3基因mRNA的表達(dá)量均處于緩慢下降過程，PIG3基因mRNA的表達(dá)量與輻照劑量呈現(xiàn)出良好的二次關(guān)系。

圖2為質(zhì)子輻照后PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間的變化。由圖2可見，隨劑量的變化，PIG3基因mRNA的表達(dá)量的峰值時(shí)間也不同。較低劑量點(diǎn)（2Gy和6Gy）在照后0～6h，PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間的延長而增加，并在照后6h達(dá)到峰值，PIG3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為10.2和19.5；照后6～12h，PIG3基因mRNA的表達(dá)量快速下降，達(dá)到6h點(diǎn)的一半左右；照后12～24h，PIG3基因mRNA的表達(dá)量繼續(xù)下降，但變化趨勢減緩；照后24～48h，PIG3基因mRNA的表達(dá)量繼續(xù)下降，在照后48h時(shí)，PIG3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為3.2和4.4，仍高于對(duì)照水平。質(zhì)子高劑量點(diǎn)（8Gy）在照后0～12h內(nèi)PIG3基因mRNA的表達(dá)水平隨時(shí)間不斷增大，在照后12h達(dá)到最大值，此時(shí)PIG3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為48.8；照后12～24h期間，PIG3基因mRNA的表達(dá)量迅速下降；照后24～48h期間，PIG3基因mRNA的表達(dá)量繼續(xù)下降，48h點(diǎn)PIG3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為5.29，仍明顯高于對(duì)照水平。

圖1 質(zhì)子輻照后AHH-1細(xì)胞PIG3基因mRNA表達(dá)量-劑量關(guān)系曲線Fig.1 Relationship curve of PIG3gene mRNA expression of AHH-1cell with dose after proton irradiation

圖2 質(zhì)子輻照后PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間的變化Fig.2 Variation of PIG3gene mRNA expression of AHH-1cell with time after proton irradiation

由圖2還可看出，PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨劑量的增大呈現(xiàn)出明顯增大的趨勢，在不同的時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量的變化雖有所不同，但整體趨勢一致。PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間的變化關(guān)系均表現(xiàn)為隨著時(shí)間的延長先增大后減小，3個(gè)劑量點(diǎn)的曲線形狀基本相似，表達(dá)量最大的時(shí)間點(diǎn)2Gy和6Gy的大致相同，8Gy的相對(duì)延后。從圖1、2的擬合曲線可看出，PIG3基因mRNA的表達(dá)量與時(shí)間和劑量具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

由圖1、2可看出，在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)子輻照正常淋巴母細(xì)胞AHH-1后，PIG3基因mRNA的表達(dá)量隨劑量的變化趨勢在不同的輻照后時(shí)間點(diǎn)基本一致，而在不同的劑量下其隨時(shí)間的變化趨勢也大致相同，因此可認(rèn)為質(zhì)子輻照正常淋巴母細(xì)胞AHH-1后，PIG3基因mRNA的表達(dá)量與劑量和時(shí)間均有很好的效應(yīng)關(guān)系，因此，PIG3基因在生物劑量計(jì)的未來應(yīng)用中具有一定的潛力。

2.2 質(zhì)子誘導(dǎo)AHH-1細(xì)胞周期分布隨劑量和時(shí)間的變化

圖3為質(zhì)子輻照后6、12、24、48h時(shí)AHH-1細(xì)胞周期的分布。由圖3可見，在照后6h，所有受照劑量點(diǎn)G2／M期細(xì)胞比例均明顯增加，表現(xiàn)出一定的G2／M期阻滯，在6Gy劑量點(diǎn)處G2／M阻滯最強(qiáng)，G2／M期細(xì)胞比例為50.9%；此外，在高劑量點(diǎn)（6Gy和8Gy）G1期細(xì)胞比例顯著減小，表現(xiàn)出G1期抑制。在照后12h后，2Gy點(diǎn)G2／M期阻滯強(qiáng)度低于6h時(shí)的，8Gy點(diǎn)G2／M期細(xì)胞比例在所有時(shí)間點(diǎn)中為最大值，6Gy劑量點(diǎn)G2／M期阻滯與6h時(shí)的相比無顯著變化。在所有時(shí)間點(diǎn)中，3個(gè)劑量點(diǎn)中6Gy點(diǎn)處G2／M阻滯最強(qiáng)烈，G2／M期細(xì)胞比例最大時(shí)為52.2%。在照后24h，所有劑量點(diǎn)G1期細(xì)胞比例與6、12h相比均有所增加，除8Gy劑量點(diǎn)外，均大致恢復(fù)到正常水平；而G2／M期細(xì)胞比例與6、12h相比均明顯減小，此時(shí)G2／M期阻滯強(qiáng)度與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，在8Gy劑量點(diǎn)處達(dá)到最大值，對(duì)應(yīng)G2／M期細(xì)胞比例約為21.3%。照后48h，所有劑量點(diǎn)G2／M期細(xì)胞比例均降至正常水平以下，而各劑量點(diǎn)G1期阻滯強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)，2Gy和6Gy點(diǎn)G1期細(xì)胞比例超過對(duì)照點(diǎn)，表現(xiàn)出G1期阻滯。

圖4為不同劑量質(zhì)子輻照后AHH-1細(xì)胞周期分布隨時(shí)間的變化。從圖4可看出，隨著輻照劑量的不同，AHH-1細(xì)胞周期分布隨時(shí)間的變化趨勢也不同。2Gy點(diǎn)細(xì)胞損傷較小，對(duì)輻射的反應(yīng)較快，在照后6h，G2／M期阻滯就達(dá)到峰值；在照后6～48h，G2／M期細(xì)胞比例呈不斷下降的趨勢；G1期細(xì)胞比例則隨時(shí)間先減小后增大，在照后48h表現(xiàn)出G1期阻滯。經(jīng)過8Gy的質(zhì)子輻照，G2／M期細(xì)胞比例隨時(shí)間先增大后減小，在照后12h達(dá)到峰值。G1期細(xì)胞比例隨時(shí)間先減小后增大，在照后6～24h，G1期細(xì)胞比例均低于對(duì)照組。6Gy劑量點(diǎn)細(xì)胞周期分布變化介于2Gy和8Gy劑量點(diǎn)之間，G2／M期細(xì)胞比例隨時(shí)間先增大后減小，在照后48h下降至正常水平以下；照后6h和12h，G2／M期細(xì)胞比例分別為50.9%和52.2%，推測G2／M期阻滯峰值時(shí)間在6～12h之間。G1期細(xì)胞比例隨時(shí)間先減小后增大，在照后6～12h表現(xiàn)為G1期抑制；在照后24～48h，6Gy點(diǎn)的G1期細(xì)胞比例超過對(duì)照點(diǎn)，表現(xiàn)出G1期阻滯。

圖3 質(zhì)子輻照后不同時(shí)間點(diǎn)AHH-1細(xì)胞周期分布與劑量的關(guān)系Fig.3 Changes in cell cycle at different time with doses after proton irradiation

圖4 不同劑量質(zhì)子輻照后AHH-1細(xì)胞周期分布與照后時(shí)間的關(guān)系Fig.4 Changes in cell cycle at different doses with time after proton irradiation

由圖3、4可看出，經(jīng)質(zhì)子輻照后，淋巴母細(xì)胞均發(fā)生了顯著的G2／M期阻滯。在同一劑量下，隨著照后時(shí)間的延長，G2／M期細(xì)胞比例先增大后減小。在同一時(shí)間點(diǎn)下，6h和12h時(shí)G2／M期細(xì)胞比例隨劑量的增大表現(xiàn)為先增大后減小，24h時(shí)G2／M期細(xì)胞比例隨劑量的增大持續(xù)增大，48h時(shí)G2／M期細(xì)胞比例隨著劑量的增大則是先呈現(xiàn)無規(guī)律減少直至最后消失。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)子束流輻照后，在不同的時(shí)間點(diǎn)PIG3基因mRNA的表達(dá)量均與劑量呈現(xiàn)效應(yīng)關(guān)系，曲線的變化大致相似，最大表達(dá)量的時(shí)間點(diǎn)也基本一致。擬合曲線和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的吻合程度也很高。由此可看出，PIG3基因mRNA與輻照劑量和輻照后的時(shí)間均具有很好的效應(yīng)關(guān)系，因此在生物劑量計(jì)的應(yīng)用上可能具有一定的基礎(chǔ)和潛力，有必要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和理論分析。

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mRNA Expression of Genes PIG3 and Cell Cycle Change of AHH-1 Cell Induced by Proton

KONG Fu-quan1，MA Nan-ru1，SUI Li1，＊，WNAG Xiao1，LIU Xiao-dan2，ZHANG Xiao-ling1，LIU Jian-cheng1，ZHOU Ping-kun2，＊
（1.China Institute of Atomic Energy，P.O.Box275-18，Beijing102413，China；2.Beijing Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Science，Beijing100850，China）

AHH-1cell was irradiated with proton（21MeV）at Q3Dmagnetic spectrometer of the tandem accelerator to study the dose-and time-effect of PIG3gene mRNA expression in AHH-1cell.Real-time quantitative PCR results show that PIG3gene mRNA expression increases with doses at the different time after proton irradiation.And the PIG3gene mRNA expression changes along with time at each dose.The peak of the PIG3gene mRNA expression appears at 6hfor every dose except the 8Gy at 12h.The results of cell cycle show that the percent of G2／M first increases and then decreases with time.These results show that PIG3gene mRNA expression in the application of biological dosimeter is potential.

proton；PIG3gene；dose；biological dosimeter

Q691.5

：A

：1000-6931（2015）05-0955-06

10.7538／yzk.2015.49.05.0955

2014-01-20；

2014-05-23

孔福全（1979—），男，河北滄州人，副研究員，博士，輻射生物專業(yè)

＊通信作者：隋 麗，E-mail：lisui＠ciae.ac.cn；周平坤，E-mail：zhoupk＠nic.bmi.ac.cn