李鑫，葛菲菲，劉健，鞠厚斌，楊德全，周錦萍，劉佩紅

上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103

·論著·

上海地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒的遺傳演化分析

李鑫，葛菲菲，劉健，鞠厚斌，楊德全，周錦萍，劉佩紅

上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103

為闡明上海地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分離株的遺傳變異、分子特征和重組模式，選取2002和2006～2014年分離自活禽市場、家禽養(yǎng)殖場和生豬屠宰場的14株H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行分析。這14株病毒分別來源于雞、鴨、鴿、野雞咽喉和泄殖腔樣品及豬肺臟樣品，用H9亞型熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒檢測后，陽性樣品經(jīng)無特定病原體(SPF)級雞胚尿囊腔接種并分離病毒，用血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定其血凝素(HA)亞型。RT-PCR分別擴(kuò)增這14株病毒全基因并進(jìn)行序列測定，分析8個基因片段的遺傳發(fā)生關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些分離株主要由F/98亞系、Y280亞系、G1亞系及未知亞系重組而成。根據(jù)8個基因片段的組合情況，這14株病毒可分成5個基因型。2002、2006～2008年分離的5株H9N2亞型禽流感病毒代表了4個不同基因型，2009～2014年分離的9株H9N2亞型禽流感病毒屬第5種基因型，推測可能與疫苗免疫選擇壓力有關(guān)。因此，在以后工作中加強(qiáng)H9N2亞型禽流感分子流行病學(xué)監(jiān)測是非常必要的。

H9N2亞型禽流感;序列測定;系統(tǒng)發(fā)育分析

Key words:H9N2 subtype avian influenza;Sequence determination;Phylogenetic analysis

禽流感是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一種禽類傳染病。目前，根據(jù)表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)基因和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)基因，禽流感病毒可分為16種HA亞型和9種NA亞型。我國大多數(shù)H9N2亞型禽流感病毒的HA和NA基因均屬BJ/94亞系(A/ chicken/Beijing/1/1994)和 G1 亞 系 (A/quail/ Hongkong/G1/1997)，而內(nèi)部基因則表現(xiàn)出明顯的多樣性［1，2］。H9N2亞型禽流感病毒能引起禽類產(chǎn)蛋下降和免疫抑制病，或與其他病原體混合感染導(dǎo)致高死亡率，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-5］。H9N2亞型禽流感病毒有多種宿主，目前已在雞、鴨、鵪鶉、野雞、鷓鴣和鴿等禽類中檢測到，是禽類中廣泛流行的流感病毒亞型［6，7］。其也能傳染給豬(豬被稱為流感病毒的“混合器”)，從而產(chǎn)生了具有新的抗原和基因特點(diǎn)的變異株［8，9］。然而，對于豬源H9N2亞型禽流感病毒是否能傳染給禽類，目前尚不清楚。近年來流行的H9N2亞型禽流感病毒具有與哺乳動物唾液酸α2，6受體結(jié)合的特性，并出現(xiàn)了人感染事件［10，11］。值得注意的是，血清學(xué)調(diào)查顯示我國人群中的H9N2抗體陽性率達(dá)13.7%～37.2%［12，13］。因此，該亞型禽流感病毒是否存在潛在的流行性引起人們廣泛關(guān)注。

本研究對2002、2006～2014年分離自上海地區(qū)活禽市場、家禽養(yǎng)殖場的13株和河南生豬屠宰場的1株H9N2亞型禽流感病毒株的全基因進(jìn)行測序，從分子生物學(xué)角度了解各毒株間的變異規(guī)律，并與我國江浙地區(qū)及其他部分地區(qū)2002～2013年的H9N2亞型禽流感病毒株、目前上海地區(qū)使用的2種疫苗株A/chicken/Shandong/6/1996和A/chicken/ Shanghai/F/1998各基因片段進(jìn)行比較，進(jìn)而從基因水平了解上海地區(qū)該亞型禽流感病毒的流行規(guī)律，并對疫苗的免疫效果進(jìn)行初步評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 病毒和雞胚

A/chicken/Shanghai/Y1/2002、 A/chicken/ Shanghai/Y1/2006、A/chicken/Shanghai/Y1/2007、A/duck/Shanghai/C60/2007、A/chicken/Shanghai/ Y2/2008、A/duck/Shanghai/C163/2009、A/swine/ Henan/Y1/2009、A/chicken/Shanghai/A/2010、A/ chicken/Shanghai/C/2011、A/chicken/Shanghai/C1/ 2012、 A/chicken/Shanghai/C2/2012、 A/pigeon/ Shanghai/JC1/2013、 A/chicken/Shanghai/1107/ 2013和 A/wild chicken/Shanghai/C1/2014由本實(shí)驗(yàn)室于2002、2006～2014年從上海地區(qū)的活禽市場、家禽養(yǎng)殖場和河南生豬屠宰場分離并鑒定，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。H9熒光反轉(zhuǎn) 錄-聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) (reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供，新城疫陽性血清、禽流感血凝素分型血清(H5、H9)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物(大連)工程公司，特異引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，AxyPrep體液病毒 DNA/ RNA小量試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的初步鑒定雞咽喉和泄殖腔樣品經(jīng)熒光RT-PCR試劑盒檢測，選取陽性樣品，處理后接種9～11日齡雞胚尿囊腔，將收集的尿囊液用β微量法進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，檢測其血凝性及血凝效價(jià)。根據(jù)所測得的效價(jià)，將尿囊液配制成4單位的溶液，分別用新城疫陽性血清及H5、H9亞型禽流感病毒陽性血清進(jìn)行血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)實(shí)驗(yàn)，以檢測該分離病毒的血凝性能否被H9亞型禽流感病毒陽性血清所抑制，詳細(xì)步驟參照GB/ T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)［14］。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列，針對8個基因片段分別設(shè)計(jì)相關(guān)引物(參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14］)。

1.2.3 病毒RNA的提取和RT-PCR提取病毒基因組RNA，具體步驟按說明書進(jìn)行。采用TaKaRa One Step RT-PCR Kit行 RT-PCR擴(kuò)增。體系為: PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μl，2×1 Step Buffer 25 μl，上、下游引物各1 μl，RNA 10 μl，加水至50 μl(參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14］)。

1.2.4 基因片段的cDNA克隆、鑒定和測序RTPCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)凝膠回收，按pMD 18-T載體說明書進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定;鑒定為陽性克隆后，送上海桑尼生物科技有限公司測序(參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14］)。

1.2.5 基因cDNA核苷酸序列分析14株H9N2亞型禽流感病毒的名稱、基因序列號、采樣地點(diǎn)及分離宿主的健康狀態(tài)詳見表1。除了A/swine/Henan/ Y1/2009外，其余13株均來源于上海本地養(yǎng)殖場。采用DNAStar 4.0的MegAlign軟件進(jìn)行分析，獲得序列的同源性及一些關(guān)鍵位點(diǎn)的變化情況(參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14］)。

表1 14株H9N2亞型禽流感病毒株Tab.1 H9N2 subtype avian influenza virus isolates used in this study

1.2.6 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹借助MEGA軟件，分析14個毒株8個基因片段的遺傳演化情況(參照文獻(xiàn)進(jìn)行［14］)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的初步鑒定結(jié)果

14株病毒的雞胚尿囊液血凝性能被H9亞型陽性血清抑制，而不能被H5亞型陽性血清和新城疫陽性血清所抑制。對NA基因測序，結(jié)果均為N2。表明這14株病毒均為H9N2亞型禽流感病毒。

2.2 cDNA全序列關(guān)鍵位點(diǎn)的分析及同源性比較

14株H9N2亞型禽流感病毒的一些關(guān)鍵位點(diǎn)詳細(xì)分析見表2。本研究中14株毒株HA基因裂解位點(diǎn)序列為PARSSRGLF或PSRSSRGLF，對禽類為低致病力(包括3株從發(fā)病雞群中分離的H9N2亞型禽流感病毒毒株)。2002年和2006年分離株HA基因的226位氨基酸為Gln(Q)，2007～2014年的分離株其226位氨基酸為Leu(L)，具有與哺乳動物唾液酸α2，6受體結(jié)合的特性［9］。所有毒株HA基因的228位氨基酸均為Gly(G)。這14株病毒在NA基因頸部均存在9個核苷酸缺失(63～65位氨基酸)。Liu等［15］報(bào)道，在我國分離到的 12株H9N2亞型禽流感病毒的NA基因頸部均存在9個核苷酸缺失，被認(rèn)為是我國H9N2亞型禽流感病毒的一個分子標(biāo)簽。本研究中14株病毒的M2蛋白31位Ser(S)均被Asn(N)取代，表明對金剛烷胺有耐藥性［16］。所有毒株的PB2蛋白627位氨基酸和701位氨基酸均為Glu(E)和Asp(D)，表明這些毒株均為禽源。這14株 H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA、M、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列的同源性分別為89.1%～99.3%、88.8%～98.8%、91.0%～99.6%、90.6%～99.1%、93.3%～99.8%、86.3%～ 99.9%、85.0%～ 99.2% 和86.8%～99.6%。

表2 分離株一些關(guān)鍵位點(diǎn)的分析Tab.2 Comparison of several key sites of H9N2 subtype avian influenza virus isolates

2.3 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹

借助MEGA軟件，建立H9N2亞型禽流感病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

2.4 14株病毒8個基因片段的遺傳演化分析

圖1 14株H9N2亞型禽流感病毒HA(115～999 nt)、NA(59～1 235 nt)、M(270～765 nt)、NP(2～1 445 nt)、NS(34～693 nt)、PA(23～1 257 nt)、PB1(182～1 080 nt)和PB2(32～2 228 nt)的基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic trees of HA(115-999 nt)，NA(59-1 235 nt)，M(270-765 nt)，NP(2-1 445 nt)，NS(34-693 nt)，PA (23-1 257 nt)，PB1(182-1 080 nt)and PB2(32-2 228 nt)genes of 14 isolates of H9N2 subtype avian influenza virus

根據(jù)繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹，對8個基因片段的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析(表3)。14株病毒株中，13株HA基因?qū)資280亞系，僅A/chicken/Shanghai/Y1/2002屬F/98亞系。用MEGA軟件計(jì)算得知，這14株病毒與2株疫苗株的遺傳距離分別為0.05～0.118(與A/chicken/Shandong/6/1996相比)和0.054～0.119 (與A/chicken/Shanghai/F/1998相比)。根據(jù)遺傳關(guān)系分析，A/chicken/Shanghai/Y1/2002和 A/ chicken/Shanghai/Y1/2006為二重重組體，由F/98亞系和Y280亞系重組而成，前者NS基因來源于Y280亞系，后者HA和M基因來源于Y280亞系。2007～2014年分離到的毒株重組方式均比較復(fù)雜，為四重或四重以上重組體，主要由F/98亞系、Y280亞系、G1亞系及未知亞系重組而成，尤其是 A/duck/Shanghai/C60/2007，其 NA和PA基因均屬未知亞系。這14株病毒經(jīng)過重組產(chǎn)生了5個不同基因型，2002年、2006～2008年分離的5株H9N2亞型禽流感病毒株分別代表4個不同基因型，2009～2014年分離的9株H9N2亞型禽流感病毒屬第5個基因型。此外，從基因片段的組成方式來看，2009～2014年分離的毒株與以前相比，來源于F/98亞系的基因片段減少了，推測可能與上海地區(qū)使用F/98疫苗后產(chǎn)生的免疫選擇壓力有關(guān)。

表3 H9N2亞型禽流感病毒的基因分型Tab.3 The genotypes of H9N2 subtype avian influenza viruses

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒在世界很多地區(qū)都有報(bào)道，包括北美、南美、歐洲、非洲、亞洲和太平洋地區(qū)。流感病毒的特點(diǎn)意味著其易于抗原漂移(antigenic drift)和抗原漂變(antigenic shift)，從而導(dǎo)致宿主范圍不斷擴(kuò)大［4］。在早期研究中，H9N2亞型禽流感病毒僅能從火雞和鴨中分離到;近年來，從雞、鳥類、豬和人類中也分離到了該病毒。這些病毒還能成為其他亞型禽流感病毒的基因片段供體，2013年感染人的 H7N9禽流感病毒多個內(nèi)部基因就來源于H9N2亞型禽流感病毒［17］。因此，繼續(xù)進(jìn)行H9N2亞型禽流感病毒的監(jiān)測有重要的公共衛(wèi)生意義。

HA蛋白是禽流感病毒毒力的主要決定因素，HA裂解為HA1和HA2是禽流感病毒感染細(xì)胞的先決條件。本研究中，14株H9N2亞型禽流感病毒的 HA基因裂解位點(diǎn)序列為 PARSSRGLF或PSRSSRGLF，均為低致病性毒株裂解位點(diǎn)的特征序列;但2007～2014年分離到的毒株其第2位氨基酸殘基由非極性氨基酸(A)突變?yōu)闃O性氨基酸(S)，這是否會影響病毒的生物學(xué)特性，還需進(jìn)一步研究。通過計(jì)算14株病毒的HA1亞單位遺傳距離，發(fā)現(xiàn)除A/chicken/Shanghai/Y1/2002外，其余13株病毒與2株疫苗株之間的遺傳距離均＞7%，顯示目前上海地區(qū)使用的2株疫苗與近年來流行的毒株已有明顯差異，可能需更換新的疫苗。通常認(rèn)為，當(dāng)流感病毒HA1亞單位遺傳距離＞7.0%時，就需更新相應(yīng)的疫苗株［18］。

本研究主要選擇了我國江浙地區(qū)及其他部分地區(qū)2002～2013年的H9N2亞型禽流感病毒株，與上海分離到的毒株進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)在相近年份從不同地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒之間沒有明顯的基因變異。目前分析顯示，其變異程度與時間更相關(guān)。本研究中的14株H9N2亞型禽流感病毒分別來源于雞、鴨、鴿、野雞和豬5種宿主，通過序列比對及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，從不同宿主中分離到的H9N2亞型禽流感病毒之間的差異并不明顯，提示禽流感病毒或許能在不同宿主中交互傳播［6，19-21］。這14株病毒均為重組體。值得注意的是，從2007年開始，分離到的毒株重組模式均比較復(fù)雜，尤其是A/duck/Shanghai/C60/2007，其HA和PB1基因來源于Y280亞系，M和PB2基因來源于G1亞系，NP和NS基因來源于F/98亞系，NA和PA基因來源則未知。有文獻(xiàn)報(bào)道［6］，對2000～2001年從中國南方家鴨中分離到的H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行抗原性和基因分析，發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)90年代在雞和鵪鶉中建立的H9N2亞型禽流感病毒基因型已返回到家鴨中，與鴨中已存在的流感病毒雜交產(chǎn)生二重體或三重體。

本研究中有3株H9N2亞型禽流感病毒 A/ chicken/Shanghai/C1/2012、 A/chicken/Shanghai/ C2/2012和A/chicken/Shanghai/1107/2013分離自發(fā)病雞群，其余毒株均分離自健康動物群體。分析表明，這3株毒株與相近年份分離的毒株沒有明顯基因變異，致病機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。但能從健康動物群體中分離到H9N2亞型禽流感病毒，提示H9亞型與其他亞型流感病毒之間有著很高的發(fā)生基因重配的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，加強(qiáng)H9N2亞型禽流感病毒的監(jiān)測并密切關(guān)注其重組趨勢有重要意義。

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第三期不明原因發(fā)熱診治進(jìn)展學(xué)習(xí)班

(會議預(yù)告)

由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院感染內(nèi)科主辦的“第三期不明原因發(fā)熱診治進(jìn)展學(xué)習(xí)班”將于2015年6月6日(星期六)在北京友誼醫(yī)院召開。我們誠摯邀請您前來參加此次學(xué)習(xí)班。

不明原因發(fā)熱的診治是臨床難題之一，給患者帶來極大的痛苦;診治過程涉及臨床各科，是對醫(yī)務(wù)人員和醫(yī)療機(jī)構(gòu)診治疑難疾病能力的巨大挑戰(zhàn)。本次學(xué)習(xí)班將圍繞不明原因發(fā)熱診治的最新進(jìn)展和疑難病例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)兩個角度對不明原因發(fā)熱診治的相關(guān)問題進(jìn)行詳細(xì)的闡述和講解，促進(jìn)各位同道的交流，促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合。我們將努力把此次學(xué)習(xí)班打造成一個良好的學(xué)習(xí)交流平臺。

初步議題

1.不明原因發(fā)熱的診斷思路;2.不明原因發(fā)熱中西醫(yī)結(jié)合診治;3.自身炎癥性疾病的診治;4.危重感染的抗生素應(yīng)用及耐藥菌治療策略;5.不明原因發(fā)熱的中醫(yī)診治;6.病例報(bào)告之一:難治性發(fā)熱一例報(bào)告;7.病例報(bào)告之二:不明原因發(fā)熱一例。

學(xué)分授予

北京市級繼續(xù)教育學(xué)分Ⅱ類2分

參會報(bào)名聯(lián)系

蔡老師

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Phylogenetic analysis of H9N2 subtype avian influenza virus isolated in Shanghai

LIXin，GE Fei-Fei， LIU Jian， JU Hou-Bin，YANG De-Quan，ZHOU Jin-Ping，LIU Pei-Hong
Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103，China

In order to explore the genetic variation and molecular characteristics of H9N2 subtype avian influenza viruses in Shanghai，fourteen H9N2 subtype avian influenza viruses were isolated from live poultry markets，poultry farms and pig slaughterhouses in 2002 and 2006-2014.These specimens included paired tracheal and cloacal swabs from chickens，ducks，pigeons and domestic wild chickens and lung samples from pigs.They were determined as H9 subtype by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)and then isolated by using 10-day-old specific pathogen free chicken eggs，further identified as H9 subtype by hemagglutination inhibition(HI)test.The eight gene segments of the fourteen virus strains were amplified by RT-PCR and sequenced.Phylogenetic analysis revealed that the isolates were reassortants mainly of A/chicken/Shanghai/F/ 1998，A/duck/HongKong/Y280/1997，A/quail/HongKong/G1/1997.Five virus strains isolated from 2002 and 2006-2008 represented four different genotypes.The other nine virus strains isolated in 2008-2014 was different from the above four genotypes.This may be related to the pressure of immune selection by vaccine.

.LIU Pei-Hong，E-mail:cathrinevet@163.com

2014-09-05)

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計(jì)劃〔滬農(nóng)青字(2014)第2-8號〕

劉佩紅