趙心宇 陳 曦 王佳琪 劉思禹 閆 宇 鄭思涵 劉純青

(大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

抑郁癥患者腦內(nèi)主要的病理生理學(xué)改變?yōu)橄虑鹉X-垂體-腎上腺軸(HPA軸)亢進(jìn)。除了下丘腦，很多其他腦區(qū)，如前額葉皮層、海馬、皮層、杏仁核、伏隔核均介入了抑郁癥發(fā)病機(jī)制。腦啡肽及強(qiáng)啡肽與神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系最為緊密。已有一些動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿片肽與應(yīng)激和焦慮關(guān)系密切，但目前對這兩種阿片肽的研究多集中在與焦慮、恐懼密切相關(guān)的杏仁核和伏隔核，對于其他腦區(qū)的研究尚未見報(bào)道。本研究通過檢測前額葉皮層、海馬、紋狀體和下丘腦區(qū)4個腦區(qū)內(nèi)這兩種阿片肽的前體蛋白——前腦啡肽(PENK)/前強(qiáng)啡肽(PDYN)的表達(dá)變化，以明確這些腦區(qū)是否也存在阿片肽的變化和參與慢性應(yīng)激的調(diào)節(jié)過程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性Wistar大鼠22只，體重220～250 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 慢性應(yīng)激動物模型的建立 動物購買后適應(yīng)1 w，5～6只為一籠，自由食水，晝夜各12 h，室溫保持在20℃左右。從22只動物中隨機(jī)選取12只為模型組，其余10只為對照組。模型組所有動物均單籠飼養(yǎng)。將5個日相刺激(束縛、40℃熱刺激、200 r/min陣 in搖、夾尾，游泳)、6個夜相刺激(傾斜籠子45°、濕籠、社會接觸、空籠、夜閃、噪音)和2個全天刺激(禁食水和晝夜顛倒)隨機(jī)安排到1 w內(nèi)，連續(xù)刺激6 w，每周各種刺激順序隨機(jī)重新組合。對照組每5只大鼠合籠飼養(yǎng)，自由食水，整個實(shí)驗(yàn)過程中不接受任何刺激。

1.3 行為學(xué)檢測 于造模前1 d和造模后的第3天進(jìn)行稱重、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮的檢測。糖水偏愛實(shí)驗(yàn):先進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，即禁食水24 h后給動物1%的葡萄糖水飲用，讓動物熟悉糖水的味道。下一次訓(xùn)練中，禁食水后同時給動物提供糖水和自來水，經(jīng)過2～3次訓(xùn)練，動物即可學(xué)會飲用糖水。檢測時記錄動物4 h內(nèi)飲用糖水和自來水的量。高架十字迷宮:先將動物置于迷宮中適應(yīng)10 min，正式實(shí)驗(yàn)時記錄5 min內(nèi)動物在暗臂內(nèi)停留的時間。一只動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以50%乙醇擦拭高架迷宮，防止氣味對下一只大鼠的行為造成影響。

1.4 熒光定量PCR檢測 行為學(xué)檢測后次日將所有動物斷頭取腦，分離前額葉皮層、紋狀體、海馬和下丘腦。新鮮組織勻漿后，應(yīng)用Trizol法(購自ambion公司)提取總RNA，瓊脂糖電泳鑒定總RNA質(zhì)量，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR擴(kuò)增按照試劑盒說明書(購自大連寶生物公司)操作，每個樣本取總RNA約1 000 ng，依次加入PrimeScript Buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物和Oligo dT引物，配制成20μl反應(yīng)體系，37℃ 15 min和85℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

根據(jù)Gene Bank的序列，由大連寶生物公司設(shè)計(jì)和合成PENK、PDYN及內(nèi)參GAPDH的引物。引物序列如下:PENK-正義:5'-TGGCTACAGTGCAGGCAGA-3'，PENK-反 義:5'-TTGTACATGTCGATGTTATCCCAAG-3';PDYN-正 義:5'-GGAGAACCCCAATACCTATTCCG-3'，PDYN-反 義:5'-GGTCTCCTGGATTCTAGGGTGG-3';GAPDH-正義:5'-TCCCATTCTTCCACCTTTGA GCT-3'，GAPDH-反義:5'-ACCCTGTTGCTGTAGGCCATATTCAT-3'。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ及上述上、下游引物配成25 μl反應(yīng)體系，95℃ 30 s;95℃ 5 s，62℃ 30 s，40 個循環(huán)條件下進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，記錄各樣本Ct值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0軟件行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 造模前(第0周)兩組動物在體重、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮的檢測中，成績無明顯差異(P＞0.05)。造模后的第6周，與對照組比較，慢性應(yīng)激組大鼠體重明顯降低(P＜0.01);對糖水的攝入量也明顯減少(P＜0.01);且停留在暗臂的時間也明顯延長(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組動物行為學(xué)檢測結(jié)果(±s)

表1 兩組動物行為學(xué)檢測結(jié)果(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

時間 組別 n 體重(g)糖水偏愛實(shí)驗(yàn)(%)高架十字迷宮(s)10 257±22 0.53±0.20 174±41應(yīng)激組 12 252±23 0.59±0.18 168±46第6周 對照組 10 334±25 0.89±0.08 241±19應(yīng)激組 12 283±292) 0.77±0.111) 266±251)第0周 對照組

2.2 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 檢測的4個腦區(qū)中前額葉皮層和下丘腦存在明顯變化(P＜0.05)，而海馬和紋狀體則無明顯變化(P＞0.05)。慢性應(yīng)激第6周，前額葉皮層中PENK表達(dá)明顯降低，為對照組的0.4倍;與之相反，PDYN的表達(dá)增加至對照組的3.5倍。下丘腦的檢測結(jié)果與前額葉皮層相似，PENK的表達(dá)明顯降低，為對照組的0.3倍;而PDYN的表達(dá)增加至對照組的2.6倍。

3 討論

抑郁癥的病因錯綜復(fù)雜、癥狀多樣、發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前國內(nèi)外廣泛認(rèn)為長期處于應(yīng)激狀態(tài)是人類形成焦慮和抑郁的主要內(nèi)在驅(qū)動力，也是抑郁癥的發(fā)病基礎(chǔ)，故對抑郁癥的科學(xué)研究普遍應(yīng)用慢性應(yīng)激動物模型。其中，慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激模型(CUMS)是目前最接近人類抑郁癥發(fā)病機(jī)制的理想模型。本實(shí)驗(yàn)參考前人的造模方法〔1〕并略加修改，整個刺激過程無動物死亡，至第6周，應(yīng)激組大鼠較對照組僅表現(xiàn)出體重減輕約30%，說明該方法屬于輕-中等程度的刺激。除體重降低外，蔗糖偏愛和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也提示本實(shí)驗(yàn)所采用的慢性刺激可成功地誘導(dǎo)出動物的抑郁樣癥狀。

人們早就熟知阿片類藥物既有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，又可引起明顯的欣快感，也因此具有成癮作用。早有研究表明內(nèi)源性阿片肽在正常情感和情緒的維持中起重要作用，這也提示阿片肽很可能與情緒障礙疾病(如抑郁癥)密切相關(guān)。每一類阿片肽都由一種特定的前體分子衍化而來，本實(shí)驗(yàn)中檢測的PENK和PDYN即為兩種阿片肽前體分子，其中PENK可衍生為甲硫氨酸腦啡肽(Met-ENK)和亮氨酸腦啡肽(Leu-ENK);PDYN又可衍生為強(qiáng)啡肽A、強(qiáng)啡肽B及α新內(nèi)啡肽。

已有研究顯示腦啡肽和強(qiáng)啡肽在抑郁癥動物模型中存在改變。Bérubé等〔2〕應(yīng)用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)慢性社會挫敗抑郁癥動物杏仁核內(nèi)PENK mRNA表達(dá)降低，而伏隔核的背側(cè)及內(nèi)側(cè)PDYN mRNA表達(dá)增加。Kung等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)腦啡肽基因敲除小鼠對傷害性刺激(如足底電擊)表現(xiàn)得更加敏感，在惡性刺激影響下更容易出現(xiàn)焦慮和抑郁，提示腦啡肽存在穩(wěn)定情緒的作用。與此研究類似，Poulin等〔4〕最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激大鼠伏隔核內(nèi)的PENK mRNA表達(dá)較對照組也呈現(xiàn)明顯的降低，而且其降低程度與糖水偏愛實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈正相關(guān)，PENK mRNA降低程度越明顯的動物，其飲用糖水量也越少。Bérubé等〔5〕應(yīng)用病毒載體特異性地敲除動物杏仁核內(nèi)腦啡肽的表達(dá)同樣可引起動物焦慮和抑郁的行為學(xué)表現(xiàn)。上述3篇文獻(xiàn)一致揭示腦啡肽通過杏仁核及伏隔核介入到以慢性應(yīng)激為基礎(chǔ)的抑郁癥發(fā)病機(jī)制中，其在抑郁癥中表達(dá)降低很可能是動物出現(xiàn)焦慮及抑郁癥狀的病理基礎(chǔ)，反過來也提示腦啡肽及其受體激動劑很可能成為治療抑郁癥的藥物。

與腦啡肽相反，Shirayama等〔6〕應(yīng)用免疫組化法觀察到習(xí)得性無助抑郁樣大鼠伏隔核和海馬內(nèi)強(qiáng)啡肽A和強(qiáng)啡肽B免疫反應(yīng)活性均增強(qiáng)，Lucas等〔7〕則應(yīng)用原位雜交法在慢性束縛應(yīng)激抑郁樣大鼠紋狀體和伏隔核內(nèi)觀察到κ受體的表達(dá)增加，提示強(qiáng)啡肽-κ受體系統(tǒng)在慢性應(yīng)激為基礎(chǔ)的抑郁癥中處于活性上調(diào)的狀態(tài)。為證實(shí)抑郁行為中強(qiáng)啡肽表達(dá)上調(diào)的意義，Chartoff等〔8〕發(fā)現(xiàn)抑郁樣大鼠服用抗抑郁藥不但可以緩解其抑郁行為，也降低了伏隔核內(nèi)強(qiáng)啡肽的表達(dá)，而且強(qiáng)啡肽基因敲除小鼠也較對照組表現(xiàn)出相對輕的抑郁樣狀態(tài)。因此，慢性應(yīng)激過程中強(qiáng)啡肽及其受體表達(dá)增加介入了抑郁樣行為表現(xiàn)，這提示κ受體拮抗劑很可能成為能夠減輕抑郁樣行為的藥物。實(shí)際上Carr等〔9〕已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)該想法，他們觀察到一種κ受體拮抗劑(DIPPA)可減輕WKY和SD大鼠的焦慮癥狀，該研究不但進(jìn)一步明確強(qiáng)啡肽在抑郁癥中的作用，作為一種臨床前探索也為抑郁癥或焦慮癥的藥物治療提供理論依據(jù)。

盡管上述研究詳細(xì)闡明了腦啡肽/強(qiáng)啡肽在抑郁癥中的作用，這些研究多局限在動物腦內(nèi)杏仁核及伏隔核，但前額葉皮層、海馬、基底節(jié)及下丘腦等腦區(qū)也均與抑郁癥密切相關(guān)。很多研究顯示抑郁癥病人額葉背側(cè)區(qū)、前扣帶回膝下部皮質(zhì)厚度減低，腦PET研究顯示海馬區(qū)糖代謝減低，基底神經(jīng)節(jié)，特別是尾狀核功能活動減弱。另有磁共振研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者前額葉皮層體積減小并與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，尸檢研究顯示下丘腦內(nèi)胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)陽性神經(jīng)元數(shù)目增多〔10〕。這些研究均提供有力證據(jù)證實(shí)這些腦區(qū)在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激大鼠前額葉皮層和下丘腦內(nèi)PENK表達(dá)降低，而PDYN表達(dá)增加，這與上述杏仁核及伏隔核的變化一致，紋狀體和海馬內(nèi)這兩個指標(biāo)則無明顯變化，說明同伏隔核及杏仁核一樣，前額葉皮層和下丘腦內(nèi)的阿片肽也參與了慢性應(yīng)激為基礎(chǔ)的抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。

阿片肽及其受體廣泛地表達(dá)在各個腦區(qū)，腦啡肽和強(qiáng)啡肽在前額葉皮層和下丘腦具有很活躍的調(diào)節(jié)作用，本研究首次在抑郁癥大鼠模型中也證實(shí)了這個假設(shè)，提示額葉皮層和下丘腦內(nèi)的阿片肽很可能參與了抑郁癥的情緒調(diào)節(jié)機(jī)制。但額葉皮層和下丘腦也包含多個核團(tuán)，每個核團(tuán)也受多種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)，故筆者觀察到的變化在抑郁癥中究竟具有何種地位及意義還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1 許 晶，李曉秋.慢性應(yīng)激抑郁模型的建立及其評價(jià)〔J〕.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003;12(1):14-7.

2 BérubéP，Laforest S，Bhatnagar S，et al.Enkephalin and dynorphin mRNA expression are associated with resilience or vulnerability to chronic social defeat stress〔J〕.Physiol Behav，2013;122(3):237-45.

3 Kung JC，Chen TC，Shyu BC，et al.Anxiety and depressive-like responses and c-fos activity in preproenkephalin knockout mice:oversensitivity hypothesis of enkephalin deficit-induced posttraumatic stress disorder〔J〕.J Biomed Sci，2010;17(1):29.

4 Poulin JF，Laforest S.Enkephalin downregulation in the nucleus accumbens underlies chronic stress-induced anhedonia〔J〕.Stress，2014;17(1):88-96.

5 BérubéP，Poulin JF，Laforest S，et al.Enkephalin knockdown in the basolateral amygdala reproduces vulnerable anxiety-like responses to chronic unpredictable stress〔J〕.Neuropsychopharmacology，2014;39:1159-68.

6 Shirayama Y，Ishida H，Iwata M，et al.Stress increases dynorphin immunoreactivity in limbic brain regions and dynorphin antagonism produces antidepressant-like effects〔J〕.J Neurochem，2004;90:1258-68.

7 Lucas LR，Dragisic T，Duwaerts CC，et al.Effects of recovery from immobilization stress on striatal preprodynorphin-and kappa opioid receptormRNA levels of the malerat〔J〕.Physiol Behav，2011;104(5):972-80.

8 Chartoff EH，Papadopoulou M，MacDonald ML，et al.Desipramine reduces stress-activated dynorphin expression and CREB phosphorylation in NAc tissue〔J〕.Mol Pharmacol，2009;75(7):704-12.

9 Carr GV，Lucki I.Comparison of the kappa-opioid receptor antagonist DIPPA in tests of anxiety-like behavior between Wistar Kyoto and Sprague Dawley rats〔J〕.Psychopharmacology(Berl)，2010;210(3):295-302.

10 周江寧.前額葉皮質(zhì)與下丘腦在抑郁癥發(fā)病中的作用〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001;36(4):247-50.