范慧晗 劉泰佐 毛金軍 歐 芹 (佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

β-淀粉樣肽(Aβ)啟動了阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病過程，并在其發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的退行性變化與認知功能缺陷程度呈現(xiàn)一致性變化〔1，2〕。而新近的研究發(fā)現(xiàn)，細胞分化調(diào)控、基因表達調(diào)控、細胞骨架構(gòu)成、細胞周期和細胞存活等一系列細胞事件與AD、糖尿病和腫瘤等發(fā)生均有關(guān)〔3〕。體外研究中有關(guān)Aβ的神經(jīng)毒性已成為不爭的事實，但關(guān)于其在體內(nèi)的毒性作用研究不多，且得到了不一致的結(jié)果。而對AD治療，目前尚無特效方法，臨床上主要為對癥治療。筆者的研究已表明，山茱萸及其多糖具有抗衰老作用，可通過提高衰老動物自由基清除能力、降低腦組織P66shc表達水平，上調(diào)FoxO蛋白表達、抑制蛋白質(zhì)非酶糖化反應實現(xiàn)，并能改善D-半乳糖(D-gal)誘導的學習記憶能力減退〔4，5〕。但關(guān)于 D-gal和Aβ1～40聯(lián)合應用對AD模型大鼠海馬區(qū)c-fos、早老素(PS)1表達的影響以及山茱萸對其作用目前尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 純種Wistar大鼠75只由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，清潔級，體重(225±25)g，雌性40只，雄性35只。隨機分為6組:青年組(YCG)12只、假手術(shù)組(SOG)10只、Aβ對照組(ADG)14只、陽性對照組14只(DON)，水煎劑組(WEG)12只，上述各組均雌雄各半;多糖組(POG)13只，雌性7只，雄性6只。除青年組大鼠外，其他各組按照60 mg/kg體重連續(xù)腹腔注射D-gal 42 d后，檢測水迷宮后行Aβ海馬注射手術(shù)。ADG、DON、WEG和 POG大鼠注射 2μl凝聚態(tài)Aβ1～40(10 μg/μl)，SOG 大鼠注射 2 μl生理鹽水。7 d后再行Morris水迷宮檢測，除ADG大鼠外，DON、POG和WEG大鼠連續(xù)經(jīng)胃灌服給藥30 d，之后再行水迷宮檢測。然后斷頭處死大鼠并分離海馬，一部分用DEPC水處理后-70℃?zhèn)溆?另一部分用10%多聚甲醛灌注行石蠟包埋，切成厚5μm切片備用。

1.2 實驗藥品 山茱萸購自佳木斯醫(yī)藥采購供應站，產(chǎn)地浙江省;山茱萸多糖購自寧波德康生物制品有限公司(批號20120110)。鹽酸多奈哌齊購自濟南德信佳生物科技有限公司(批號12072701)。取干燥山茱萸果實，粉碎后蒸餾水浸泡24 h，加熱煎煮提取、抽提2次，多糖及水煎劑分別于用前采用雙蒸水配置成0.057 g生藥/ml的溶液。Aβ1～40購自上海瑞奇生物科技有限公司(批號RA130310)，用前制成10μg/μl凝聚態(tài)溶液。特異性抗Tau蛋白、抗P-Tau蛋白抗體購自中山醫(yī)科大學。Trizol總RNA抽提試劑、DNA marker(DL2000)、TaKaRa RT-PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司，DEPC購自Sigma公司，引物為上海生工公司合成，其余藥品為國產(chǎn)分析純。

1.3 指標檢測 采用Morris水迷宮法評價學習記憶能力，Tau蛋白、P-Tau蛋白表達的檢測采用免疫組化法，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，以P-Tau/總Tau(P-Tau/Tau)光密度值表示Tau蛋白磷酸化水平。采用 RT-PCR檢測c-fos和PS1表達，選擇Oligo dT-Adaptor Primer引物合成cDNA。Primer premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，c-fos:正義引物5'GACAGCCTTTCCTACTACCATTCC 3'，反義引物 5'TATTCCTTTCCCTTCGGATTCTC 3'，擴增片段長度370 bp;PS1:正義引物5'TTACCAGGCAGGTGATAGAGCAAG 3'，反 義 引 物 5'AGATGAAACAATAAGCCAGGCATG 3';擴增片段長度338 bp;采用β-actin為內(nèi)參，正義引物5'ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3'，反義引物5'CTCCTGCTTGCTGATCCACATC 3'，擴增片段長度為399 bp。按照94℃5 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 25 s，41 個循環(huán);72℃ 7 min，進行PCR。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，以同一樣品的目的基因與內(nèi)參照基因β-actin擴增產(chǎn)物的吸光度之比值表示mRNA表達水平。采用比色分析法測定AChE活性，以每mg組織蛋白在37℃保溫6 min，水解反應體系中1μmol基質(zhì)為1個活力單位。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用F檢驗，單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，方差不齊者采用秩和檢驗;用藥前后學習記憶比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 AD模型大鼠學習記憶能力的變化及山茱萸多糖的作用

2.1.1 造模前后及給藥后逃避潛伏期的測定結(jié)果 與YCG組比較，大鼠手術(shù)前和造模后的逃避潛伏期均明顯延長(P＜0.01)，造模后大鼠的潛伏期也明顯長于手術(shù)前(P＜0.01)，且手術(shù)前各組大鼠逃避潛伏期與SOG組之間無明顯差異(P＞0.05);ADG、DON、POG和WEG大鼠在造模后逃避潛伏期無明顯差異(P＞0.05);而與造模后比較，DON、POG和WEG大鼠在給藥30 d后明顯縮短(均P＜0.01)，且與ADG比較明顯縮短(P＜0.01或P＜0.05)，3個用藥組之間差異無統(tǒng)計學意義，且各組均未達到手術(shù)前及YCG大鼠水平。見表1。

2.1.2 大鼠空間探索能力的檢測 以單位時間內(nèi)(60 s)跨越平臺次數(shù)表示，SOG、ADG、DON、POG和WEG大鼠跨越平臺次數(shù)在手術(shù)前無顯著差別，但較YCG明顯減少(均P＜0.05);與YCG大鼠比較，造模后各組大鼠跨越平臺次數(shù)均明顯減少(均P＜0.01)，但各組間無顯著差別(P＞0.05)，且均顯著少于手術(shù)前(均P＜0.01)，并且與SOG大鼠比較均顯著降低(P＜0.01);與ADG比較，DON、POG和WEG大鼠跨越次數(shù)均顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)，但3組之間比較未見明顯差異(P＞0.05)，亦均未達到青年組和手術(shù)前水平。見表2。

2.2 AD模型大鼠海馬乙酰膽堿酯酶(AchE)活性、Tau蛋白表達的變化及山茱萸的作用 SOG、ADG、DON、POG和WEG大鼠AchE活性較YCG明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);與SOG比較，ADG、DON、POG和WEG大鼠AchE活性均明顯增高(P＜0.01或P＜0.05);與ADG比較，多奈哌齊、山茱萸多糖及水煎劑可明顯降低AchE活性(均P＜0.01)，其中POG顯著高于DON大鼠(P＜0.05)，但POG與WEG之間無顯著差別(P＞0.05)。由圖1可見，各組之間Tau蛋白表達無明顯差別(P＞0.05)。由表3、圖2可見，ADG大鼠P-Tau表達量明顯高于YCG和SOG(P＜0.05，P＜0.05);與 ADG比較，DON、POG和WEG大鼠P-Tau蛋白表達顯著減少(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)，且明顯高于 SOG(P ＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.05)。P-Tau/Tau比較結(jié)果可見，DON、POG和WEG大鼠P-Tau/Tau水平顯著低于ADG(均P＜0.05)，但未達到Y(jié)CG和SOG大鼠水平。

2.3 AD模型大鼠海馬區(qū)PS1、c-fos mRNA表達 由表4、圖3和圖4可見，與YCG組比較，SOG、ADG、DON、POG和 WEG大鼠海馬PS1 mRNA表達水平明顯增加(均P＜0.01)、c-fos表達明顯下降(均P＜0.01);與SOG組比較，ADG大鼠PS1表達顯著增高(P＜0.01)，c-fos的表達則顯著降低(P＜0.05);山茱萸多糖和水煎劑均可降低AD模型大鼠PS1表達(P＜0.01，P＜0.01)，上調(diào)c-fos表達(P ＜0.01，P ＜0.01)，且其作用效果與DOG大鼠無顯著差異(P＞0.05)。3個用藥組比較，山茱萸多糖對PS1表達的調(diào)節(jié)作用與水煎劑和陽性藥物比較差異顯著(P＜0.05)。

表1 AD大鼠逃避潛伏期的變化及山茱萸對其影響(x ± s，s)

表2 AD模型大鼠空間探索能力及山茱萸對其影響(±s，次)

表2 AD模型大鼠空間探索能力及山茱萸對其影響(±s，次)

12 7.103±0.676 - -SOG組 10 5.740±0.4931) 5.374±0.5482) 5.331±0.4932)ADG組 14 6.235±0.6361)3.762±0.4422)3)4)3.843±0.3982)4)DON組 14 6.084±0.7371)3.784±0.4352)3)4)4.554±0.5142)4)8)POG組 13 6.118±0.7961)3.695±0.4682)3)4)4.468±0.5112)4)7)WEG組 12 6.225±0.8461)3.676±0.4822)3)4)4.507±0.5272)4)7)手術(shù)前 造模后 給藥后YCG組組別 n

表3 各組大鼠海馬AchE活性、P-Tau蛋白水平變化(±s)

表3 各組大鼠海馬AchE活性、P-Tau蛋白水平變化(±s)

12 0.851±0.087 0.326±0.021 0.454±0.061 SOG組10 1.062±0.1151) 0.329±0.017 0.5424±0.056 ADG組14 1.465±0.1572)4) 0.398±0.0121)12)0.631±0.0842)4)DON組14 1.148±0.1652)12)0.356±0.0131)7)12)0.561±0.0662)7)POG組13 1.205±0.1442)4)8)11)0.366±0.0101)7)12)0.545±0.0581)7)WEG組12 1.185±0.1422)8) 0.372±0.0151)7)0.535±0.0561)7)P-Tau P-Tau/Tau YCG組組別 n AchE(U/mg.pr)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Tau表達(×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)P-tau表達(×400)

圖3 海馬區(qū)c-fos RT-PCR電泳結(jié)果

圖4 海馬區(qū)PS1 RT-PCR電泳結(jié)果

表4 各組海馬c-fos、PS1 mRNA表達水平(±s)

表4 各組海馬c-fos、PS1 mRNA表達水平(±s)

12 0.702 3 ±0.024 2 0.160 2 ±0.019 0 SOG組 10 0.361 2±0.023 72) 0.348 2±0.034 32)ADG組 14 0.313 7±0.035 62)12) 0.706 3±0.071 72)4)DON組 14 0.607 7±0.034 52)4)8) 0.576 3±0.050 32)4)8)POG組 13 0.630 0±0.084 62)4)8)0.501 3±0.078 62)4)8)9)11)WEG組 12 0.613 1 ±0.059 72)4)8) 0.574 7±0.069 02)4)8)-actin YCG組組別 n c-fos/β-actin PS1/β

3 討論

AD發(fā)病原因、機制和過程均十分復雜，研究者根據(jù)條件和研究目的等提出了多種模擬AD的動物模型制備方法，本研究說明D-gal和聯(lián)合Aβ注射均能復制出AD的學習記憶能力的障礙，而聯(lián)合Aβ注射更接近人類AD患者的漸進性病理學變化〔6，7〕。研究者們常通過測定膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶或AchE活性來衡量Ach的水平，而在AD的發(fā)生中學習記憶能力障礙與腦組織 AchE活性改變密切相關(guān)〔8，9〕。本研究結(jié)果表明，AD模型大鼠海馬區(qū)Ach的代謝發(fā)生異常較單純的D-gal誘導更為顯著，Aβ可能是通過加快Ach代謝的速度而使大鼠學習記憶能力發(fā)生進一步減退，其作用機制可能與Aβ的神經(jīng)毒性、c-fos低表達和PS1表達的增加有關(guān)。

本研究顯示，多奈哌齊、山茱萸多糖和山茱萸水煎劑明顯降低海馬區(qū)AchE活性，從而可減緩Ach的降解速度。當AD發(fā)生時，由于AchE活性的提高加速了Ach的降解，致使海馬中Ach水平的不足。有的學者認為Ach的不足與Meynert底核神經(jīng)元的丟失有關(guān)〔10〕。本實驗結(jié)果還表明，山茱萸多糖的作用與多奈哌齊有差異，但水煎劑和多糖之間對AchE活性的影響無顯著差別，說明山茱萸對AchE活性的調(diào)節(jié)與多糖提取部位有關(guān)，但沒有多奈哌齊和水煎劑顯著，這可能與水煎劑的藥物成分較多糖更為復雜，山茱萸的其他有效部位也可調(diào)節(jié)AchE活性有關(guān)。

c-fos可受內(nèi)皮素等誘導在多種細胞中表達，其表達水平與磷酸化可能直接影響細胞增殖、細胞周期調(diào)控、細胞分化以及軸突的生長等，乃至引起細胞的死亡。在正常細胞中呈現(xiàn)比較恒定的低表達。本研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸多糖及水煎劑可上調(diào)c-fos的mRNA表達水平，這種表達上調(diào)可能通過影響多種ERK或PKC的活化。研究發(fā)現(xiàn)，當c-fos表達增加時，常伴有c-jun的表達，而c-jun與c-fos之間的親和力要較其與ATF2的更強，通過c-fos與c-jun異二聚體形成干擾了c-jun與ATF2的結(jié)合，而后者介導的細胞凋亡信號也會隨之減弱，從而發(fā)揮c-fos對神經(jīng)元的保護作用。對PS1表達的結(jié)果表明，D-gal及其與Aβ聯(lián)合使用均可引起海馬組織PS1mRNA表達的顯著高于YCG，多奈哌齊、山茱萸多糖及水煎劑可降低AD模型大鼠PS1的表達水平。目前，PS1對腦功能的損害作用已成不爭之事實〔11〕，其在AD的發(fā)生中有重要的作用。PS1可能是作為γ-分泌酶的催化組分而影響其活性，進而影響Aβ的產(chǎn)生和聚集〔12〕。當PS1過表達時，可使Aβ升高并且聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性。目前的研究除了發(fā)現(xiàn)PS的突變促進APP的轉(zhuǎn)運和代謝過程外，還發(fā)現(xiàn)PS1對APP的作用與notch信號及細胞凋亡有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，PS能通過與Tau蛋白結(jié)合，進而促進GSK3β對Tau蛋白的磷酸化，加快神經(jīng)纖維纏結(jié)，并對膽堿能表達產(chǎn)生損害。因此筆者推測，山茱萸多糖及水煎劑可能通過降低模型大鼠PS1的表達水平，從而降低Tau磷酸化可能與PS1參與的APP水解釋放和膽堿能損傷有關(guān)。

綜上所述，山茱萸多糖及水煎劑與多奈哌齊均可提高AD模型大鼠的學習記憶能力，其機制與其上調(diào)c-fos的mRNA表達水平、降低P-Tau水平、降低PS1表達和乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。山茱萸多糖和水煎劑的作用無顯著差別，說明多糖是山茱萸提高AD模型大鼠學習記憶能力的重要成分。

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