郭紅玲

【摘 要】 目的：建立我院膏方微生物限度檢查方法。方法：根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定，對(duì)我院補(bǔ)肺膏等10個(gè)基礎(chǔ)膏方進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。結(jié)果：補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽(yáng)培補(bǔ)膏等4種膏方具有一定的抑菌作用，其余6種膏方無(wú)抑菌作用。結(jié)論：補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽(yáng)培補(bǔ)膏4種膏方采用培養(yǎng)基稀釋法檢查其微生物限度；補(bǔ)腎膏、三仙滋補(bǔ)膏、益智安神膏、滋陰潤(rùn)燥膏、兒童健脾開(kāi)胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎(chǔ)膏方用常規(guī)平皿法檢查微生物限度。

【關(guān)鍵詞】 膏方；微生物限度；方法建立

【中圖分類號(hào)】R446.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）11-0007-03

膏方又稱“膏滋”或“煎膏”，是最古老的劑型之一[1] ，多具有滋補(bǔ)，預(yù)防與治療作用，特別是對(duì)于亞健康與體弱多病者的調(diào)養(yǎng)效果顯著。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，中醫(yī)藥養(yǎng)生知識(shí)的大量普及[2] ，使膏方在各地區(qū)也越來(lái)越得到大眾的認(rèn)可。

目前，各醫(yī)院制作的膏方無(wú)統(tǒng)一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，且文獻(xiàn)對(duì)膏方質(zhì)量控制的報(bào)道不多，特別是微生物方面的文獻(xiàn)更少[3] 。然而，醫(yī)院膏方的制作多采用手工傳統(tǒng)制作方法，容易受操作器具、原輔料及環(huán)境微生物污染，有必要對(duì)醫(yī)院制作的基礎(chǔ)膏方建立相應(yīng)的微生物限度檢驗(yàn)方法，以確保衛(wèi)生學(xué)的安全性。根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》附錄的規(guī)定，在藥品進(jìn)行檢驗(yàn)前必須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。故本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》一部附錄要求，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4-7] ，對(duì)我院補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏、糖尿病膏等10種基礎(chǔ)膏方進(jìn)行微生物限度檢測(cè)方法摸索，建立了我院基礎(chǔ)膏方微生物限度檢驗(yàn)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（湖南衡陽(yáng)金一帆制藥設(shè)備實(shí)業(yè)有限公司）；XPX-150型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；MJ-160-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）；紫外儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 材料

1.2.1 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 、大腸埃希菌[CMCC（B）22102] 、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501] 、白色念珠菌[CMCC（F）98001] 、黑曲霉菌[CMCC（F）9003] ，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 培養(yǎng)基 膽鹽乳糖增菌液（批號(hào)：120627）、玫瑰紅鈉瓊脂（批號(hào)：120522）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)120423）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)：121205）為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品；改良馬丁（批號(hào)：120215）、改良馬丁瓊脂（批號(hào)：121025）為杭州微生物試劑公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 菌液的制備 按照2010版《中國(guó)藥典》一部附錄ⅫⅠ[7 ] 要求制備。

2.2 供試液的制備 取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證方法（平皿法）

2.3.1 試驗(yàn)組 取“2.1”項(xiàng)下菌液1ml和“2.2”項(xiàng)下1：10供試液1ml，注入同一直徑為90mm的平皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，平行制備2個(gè)平皿。

2.3.2 菌液組 分別取“2.1”中的每一種試驗(yàn)菌加入培養(yǎng)皿中，注入45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿，細(xì)菌置于30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)；霉菌置于25℃培養(yǎng)72h，每日觀察測(cè)定菌液菌落數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組 取“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液1ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測(cè)定供試品本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取“2.1”項(xiàng)下菌液1ml和“2.2”項(xiàng)下稀釋劑1ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測(cè)定其菌落數(shù)。

2.4 培養(yǎng)基稀釋法

2.4.1 試驗(yàn)組 取“2.2”項(xiàng)下1∶10的供試液的供試液2ml，每1ml供試液分別等量注入5個(gè)平皿中，每10個(gè)皿為一組。取“2.1”項(xiàng)下金黃色葡萄球菌菌液1ml，分別注入上述培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，置于30～35℃培養(yǎng)48h，測(cè)定其菌落數(shù)。

2.4.2 菌液組 取“2.1”項(xiàng)下金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌液1ml加入培養(yǎng)皿中，注入45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿，細(xì)菌置于30～35℃培養(yǎng)48h，每日觀察測(cè)定菌液菌落數(shù)。

2.4.3 供試品對(duì)照組 取“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液0.2ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測(cè)定供試品本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取“2.1”項(xiàng)下菌液1ml和“2.2”項(xiàng)下稀釋劑0.2ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測(cè)定其菌落數(shù)。

2.5 控制菌檢查方法驗(yàn)證

2.5.1 供試液制備 同“2.2”項(xiàng)下供試液制備。

2.5.1.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項(xiàng)下制備的大腸桿菌陽(yáng)性菌液1ml注入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃，培養(yǎng)18～24h后，取該培養(yǎng)物0.2ml，接種至5mlMUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，分別于5h、24h置366nm紫外光下觀察有熒光反應(yīng)，沿試管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色。

2.5.1.2 陰性對(duì)照組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項(xiàng)下制備的金黃色葡萄球菌陽(yáng)性菌液1ml注入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃，培養(yǎng)18～24h后，取該培養(yǎng)物0.2ml，接種至5mlMUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，分別于5、24h置366nm紫外光下觀察無(wú)熒光反應(yīng)，沿試管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈本色，結(jié)果為陰性。

2.5.2 大腸菌群檢查方法驗(yàn)證

2.5.2.1 供試液制備 取1∶10的溫陽(yáng)培補(bǔ)膏供試液采用逐級(jí)稀釋法，稀釋為1∶100，1∶1000的供試液。

2.5.2.2 試驗(yàn)組 分別取“2.5.2.1”項(xiàng)下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，并分別加入“2.1”項(xiàng)下制備的大腸桿菌陽(yáng)性菌液1ml，培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

2.5.2.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋液1ml加入10ml乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果，結(jié)果為陰性。

2.5.2.4 供試品檢查 分別取“2.5.2.1”項(xiàng)下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，按2010版《中國(guó)藥典》一部附錄要求操作，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 菌數(shù)回收率的計(jì)算

[HT6”SS][JP3]稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率（%）=稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)×100%[JP]

[JP4]試驗(yàn)組菌數(shù)回收率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-共試品對(duì)照組平均菌落數(shù)菌液組的平均菌落數(shù)×100%[JP][HT]

《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定各試驗(yàn)菌株的回收率（%）均得大于70%。

3.2 常規(guī)平皿法驗(yàn)證結(jié)果 用常規(guī)平皿法對(duì)10種膏方的細(xì)菌、霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽(yáng)培補(bǔ)膏四種基礎(chǔ)膏方用常規(guī)平皿法測(cè)定其枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率在70%以下，說(shuō)明該四種基礎(chǔ)膏方對(duì)草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng)；改用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表2，但白色念珠菌、大腸埃希菌及黑曲霉菌回收率均在70%以上，說(shuō)明其對(duì)這3種菌無(wú)抑菌作用，可以用常規(guī)平皿法測(cè)定這三種膏方的霉菌與酵母菌。補(bǔ)腎膏、三仙滋補(bǔ)膏、益智安神膏、滋陰潤(rùn)燥膏、兒童健脾開(kāi)胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎(chǔ)膏方用常規(guī)平皿法測(cè)定其細(xì)菌與霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證回收率均在70%以上，說(shuō)明可以用常規(guī)平皿法對(duì)補(bǔ)腎膏、三仙滋補(bǔ)膏、益智安神膏、滋陰潤(rùn)燥膏、培元固衛(wèi)膏、兒童健脾開(kāi)胃膏進(jìn)行細(xì)菌與霉菌及酵母菌的微生物限度測(cè)定。

3.3 培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證結(jié)果 用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)補(bǔ)肺膏等4種基礎(chǔ)膏方的霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)定法進(jìn)行驗(yàn)證。有表2可知，枯草胞桿菌及金黃色葡萄球菌回收率均在70%以上，說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法可以用于補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏和糖尿病膏的微生物限度測(cè)定。

3.4 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果 采用2010版《中國(guó)藥典》一部附錄方法對(duì)10種膏方的控制菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均符合要求，結(jié)果表明可以采用常規(guī)法，對(duì)我院各膏方進(jìn)行控制菌微生物限度檢查。

4 討論

中藥膏方是自古以來(lái)就有的傳統(tǒng)中藥劑型之一，不僅是單純的補(bǔ)藥，兼有治療和預(yù)防，即“祛病糾偏”的雙重療效，集補(bǔ)、調(diào)、療的綜合功效[8、9] ，在養(yǎng)生、慢性疾病及治未病方面起到良好的療效。隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快，亞健康人群的不斷壯大及養(yǎng)生觀念的不斷加強(qiáng)，冬令膏方在我國(guó)越來(lái)越受到重視，但關(guān)于其質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道較少，特別是微生物限度測(cè)定的更少。因膏方含藥味多，處方量大，在制作過(guò)程中可能會(huì)受到微生物污染，為了保證其安全，根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》的要求，對(duì)我院自制的10種基礎(chǔ)膏方進(jìn)行微生物限度測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了我院基礎(chǔ)膏方微生物限度測(cè)定的方法。

通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有清熱解毒類、化痰止咳類中藥材的膏方，因部分藥材本身具有較強(qiáng)的抑菌作用，其加工制備后仍具有一定的抑菌作用。常規(guī)平皿法不能直接用于該類膏方的微生物限度測(cè)定，而選用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。通過(guò)驗(yàn)證，我院基礎(chǔ)膏方的霉菌與酵母菌檢查法基本都可以采用常規(guī)法測(cè)定。補(bǔ)肺膏、養(yǎng)顏調(diào)經(jīng)膏、溫陽(yáng)培補(bǔ)膏、糖尿病膏等膏方的細(xì)菌檢查法需采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定?？刂凭鷻z查都可以采用2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定的常規(guī)法進(jìn)行。

通過(guò)對(duì)膏方微生物限度的測(cè)定方法的驗(yàn)證，制定合適的膏方微生物限度測(cè)定方法，確保膏方在制作的過(guò)程中不被微生物污染，避免膏方在患者服藥的長(zhǎng)期貯存中霉變而變質(zhì)，保證患者用藥的安全性，為膏方質(zhì)量控制的制定提供一定的基礎(chǔ)。

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