栗建明 莫結(jié)麗

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法測定小柴胡顆粒中黃芩苷含量的不確定度評價方法。方法：采用高效液相色譜法測定小柴胡顆粒中黃芩苷含量。根據(jù)檢驗(yàn)過程，建立數(shù)學(xué)模型，分析影響其不確定度因素來源，對各個不確定度因素進(jìn)行評定，得出擴(kuò)展不確定度。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)展不確定度為U=0.02mg/袋（k=2）。結(jié)論：高效液相色譜法測定小柴胡中黃芩苷含量的不確定度主要由對照品稱量、稀釋過程和測得的色譜峰面積引入。

【關(guān)鍵詞】 小柴胡顆粒；黃芩苷；高效液相色譜法；不確定度分析

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）11-0011-03

測量不確定度是表征合理賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，是用來確定測量結(jié)果的可信程度[1]。目前，測量不確定度在藥品檢驗(yàn)分析領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛[2-3]。筆者根據(jù)《測量不確定度評定與表示》[1]，并參考《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[4]，對《中國藥典》2010年版一部小柴胡顆粒[5]中黃芩苷的HPLC含量測定進(jìn)行不確定度分析，以期找出影響不確定度的因素，并對其評定，計(jì)算合成不確定度，給出測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度，為測量結(jié)果的準(zhǔn)確提供依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters2695-2487高效液相色譜儀；德國sartorius電子分析天平（型號：CP225D、CP224S）。

1.2 材料 黃芩苷對照品（批號：110715-201318，中國藥品生物制品檢定所提供）；小柴胡顆粒（批號：140506，廣州白云山光華制藥股份有限公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂 MG C18 （250×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）；檢測波長：315nm；柱溫：30℃；流速：1.0ml/min。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于8000。

2.2 對照品溶液的制備 稱取黃芩苷對照品約12mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5ml置20ml容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，制成每1ml含黃芩苷60μg的溶液，作為對照品溶液[8]。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[8]。

2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，按外標(biāo)法（峰面積）計(jì)算出樣品中黃芩苷的含量。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 小柴胡顆粒的平均裝量為10.2283g/袋，其余數(shù)據(jù)見表1、2。

3 測量數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)測定原理，黃芩苷含量計(jì)算公式如下：

X=A樣×W對×P對×V樣×WV對×A對×W樣

式中：供試品每袋含黃芩苷的含量（mg/袋）；A樣：供試品的峰面積；A對：對照品的峰面積；W對：對照品的稱取量（mg）；W樣：供試品的取樣量（g）；P對：對照品的純度（%）； V樣：樣品的稀釋體積（ml）；V對：對照品的稀釋體積（ml）；W—：平均裝量（g/袋）。

4 不確定度來源的識別及分析

4.1 不確定度的來源 由上述實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)學(xué)模型可知，影響小柴胡顆粒中黃芩苷含量測定結(jié)果的不確定度因素有：供試品和對照品稱量過程、稀釋過程；儀器測定供試品和對照品峰面積的重復(fù)性；樣品平均裝量的稱量；對照品的純度以及其它因素。幾個分量的影響因素相互獨(dú)立，按測量不確定度評估程序，分別進(jìn)行不確定度的分析評估。

4.2 對照品引入的不確定度

4.2.1 對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

稱量使用德國sartoriusCP225D電子分析天平（Max80g，d=0.01mg），為1級工作天平。①天平示值不確定度：天平的檢定證書給出其示值最大允差為±0.05mg（0≤m≤5000mg），按均勻分布k=3 計(jì)算，不確定度為μ1=0.053 = 2.89×10 - 2mg。②天平稱量重復(fù)性不確定度：天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.02mg，按照均勻分布計(jì)算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μ2=0.023 = 1.15×10 - 2mg。天平引入的不確定度為μ=μ12+ μ22 = 3.11×10 - 3，由于對照品采用的是減重法稱量，稱量了兩次，所以對照品1稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，同理對照品2稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

4.2.2 對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 黃芩苷對照品（批號：110715-201318，中國藥品生物制品檢定所）未提供不確定度值，假設(shè)分布區(qū)間的半峰寬為±0.05%，按均勻分布k=3，故由對照品純度而引入的相對不確定度urel（P對）=0.053×93.3%=3.10×10-4

4.2.3 對照品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 ①玻璃儀器校準(zhǔn)的不確定度：屬B類不確定度。對照品稀釋過程中用到容量瓶50ml（A級）、20ml（A級），單標(biāo)線吸管5ml（A級），容量允差分別為±0.05、±0.03、±0.015，在一個有效的生產(chǎn)過程中標(biāo)定值比極限值出現(xiàn)的可能性更高，按三角分布計(jì)算優(yōu)于均勻分布，k=6。②溫度：實(shí)驗(yàn)時容量瓶、吸管和溶液的溫度與玻璃儀器校準(zhǔn)（20℃）的溫度差異變化為±5℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4，屬于B類不確定度，按矩形分布評定。由表3結(jié)合對照品的稀釋過程，對照品稀釋引入的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（V對）=u2rel（V50）+u2rel（V25）+u2rel（V5）=1.43×10-3。

4.2.4 對照品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（A對）對照品溶液A對1、A對2分別進(jìn)樣2次，均以色譜峰面積計(jì)算。對照品溶液1峰面積分別為1312423和1312944，平均峰面積為1312684采用極差法計(jì)算，n=2，C=1.13，同理對照品溶液2峰面積分別為1262733和1266039，對照品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確度。

4.3 供試品引入的不確定度

4.3.1 供試品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 稱量使用德國sartoriusCP224S電子分析天平（Max220g，d=0.1mg），為1級工作天平。①天平示值不確定度：天平的檢定證書給出其示值最大允差為±0.5mg（50g≤m≤200g），按均勻分布k=3計(jì)算，不確定度為u1=0.53 =0.2887mg。②天平稱量重復(fù)性不確定度：天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.1mg，按照均勻分布計(jì)算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2=0.13 = 0.0577mg。天平引入的不確定度為u=u2+ u22=0.2944，所以供試品1稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；同理，供試品2稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為9.81×10-5，則供試品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（W樣）=u2rel（W樣1）+u2rel（W樣2）2=9.81×10-5

4.3.2 供試品稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 供試品配制過程中只使用了1個A級50ml單標(biāo)線吸管，容量允差±0.05，按三角分布：k=6 ，引入的相對不確定度為7.31×10-4（見表3）。

4.3.3 供試品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 供試品溶液各進(jìn)樣2次，均以色譜峰面積計(jì)算。采用極差法計(jì)算，n=2，C=1.13；進(jìn)樣10μl時urel（A樣1）=RC×A樣1=2643964-26356711.13×2639817=2.78×10-3，urel（A樣2）=RC×A樣2=2645071-26380731.13×2641772=2.21×10-3供試品峰面積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（A樣）=urel2（A樣）+urel2（A樣2）2=2.51×10-3

4.3.4 供試品平均裝量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（W）本品平均裝量10.2283g/袋，參照供試品稱量引入的相對不確定度，平均裝量引入的相對不確定度urel（W）=uW=0.294410228.3 = 2.87×10-5

4.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 各相對不確定度分量見表4。

4.5 擴(kuò)展不確定度 本品測得小柴胡顆粒中黃芩苷含量X=20.2mg/袋，測得結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：uc（X）=X×urel（X）=20.2×5.04×10-3=0.101mg/袋。

按95%的置信概率，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度：U=k×uc（X）=2×0.101=0.2mg/袋。

4.6 不確定度測量報告 根據(jù)不確定度評定結(jié)果，小柴胡顆粒中黃芩苷的含量測定結(jié)果可表示為：X=（20.2±0.2）mg/袋。

5 討論

試驗(yàn)對小柴胡顆粒中黃芩苷含量進(jìn)行了不確定度分析評定，由評定結(jié)果可以看出（見表1），測得色譜峰面積、對照品稱量和對照品稀釋過程對不確定度貢獻(xiàn)比較大，對照品純度、樣品稱量及樣品稀釋過程、樣品的平均裝量對不確定度貢獻(xiàn)較小。

不確定度評定結(jié)果提示，在今后在實(shí)際檢驗(yàn)過程中，首先要保證實(shí)驗(yàn)所用的儀器、計(jì)量器具等均應(yīng)計(jì)量檢定合格，并注意日常的維護(hù)和保養(yǎng)，對照品的稱量應(yīng)選擇合適量程及精度的電子分析天平，以提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性；其次在實(shí)驗(yàn)時適當(dāng)增加對照品的取樣量、稀釋過程盡可能選用容量相對較大的量具并盡可能減少稀釋步驟，增加平行樣測定，也可以適當(dāng)減少不確定度分量所占的比重。

采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析時，應(yīng)盡量使配制的樣品組分的濃度與對照品濃度接近，以降低實(shí)驗(yàn)誤差。本文中供試品溶液按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)進(jìn)樣10μl，樣品中黃芩苷的峰面積是黃芩苷對照品峰面積的兩倍，測定結(jié)果為20.2mg/袋；而進(jìn)樣5μl，樣品中黃芩苷的峰面積與黃芩苷對照品峰面積接近，測定結(jié)果為19.3mg/袋。兩個測定結(jié)果一個高于限度，一個低于限度，但不確定度基本相同。分析其原因是供試品溶液進(jìn)樣10μl，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算時產(chǎn)生了較大的實(shí)驗(yàn)誤差。《中國藥典》2010年版一部小柴胡顆粒[4]項(xiàng)下規(guī)定：本品每袋含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)，不得少于20.0mg。按樣品的取樣量、稀釋倍數(shù)和規(guī)定限度折算，黃芩苷對照品溶液的配制濃度應(yīng)為120μg/ml。但標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定對照品配制濃度應(yīng)為60μg/ml，本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果表明該含量測定方法存在著一定缺陷，需在今后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高中進(jìn)行進(jìn)一步完善。

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