黃麗俊　李利東　宓曉黎

摘要：對(duì)已有方法和規(guī)范中樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化和對(duì)比研究，建立檢測(cè)蟲草制品中腺苷和蟲草素含量的反相高效液相色譜方法。樣品經(jīng)水超聲提取40min，離心過濾后進(jìn)行分析。采用C₁₈色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以水-甲醇（85：15，V/V）為流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。本方法檢測(cè)限為0.2μg/mL，定量限為1.0μg/mL。以所建立的方法對(duì)蟲草制品進(jìn)行分析，樣品加標(biāo)回收率在94%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，并能同時(shí)測(cè)定腺苷和蟲草素。

關(guān)鍵詞：蟲草制品；高效液相色譜；腺苷；蟲草素

中圖分類號(hào)：O657.7+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號(hào)：2014-0289

0引言

蛹蟲草為子囊菌亞門麥角菌目麥角菌科蟲草屬的模式種，又名北冬蟲夏草，可人工批量培育，與冬蟲夏草是同屬，2009年被批準(zhǔn)為新資源食品。由于蟲草具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用而引發(fā)人們的關(guān)注，并深度開發(fā)，目前市場(chǎng)上有以蟲草為原料的各類藥品、保健食品及食品，其劑型有含片、膠囊、口服液、固體飲料、酒等。中國藥典2010版冬蟲夏草項(xiàng)下腺苷含量測(cè)定采用HPLC法，CFDA用HPLC測(cè)定蛹蟲草菌粉中蟲草素含量，《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版（簡(jiǎn)稱《規(guī)范》）中的要求以蟲草為主要原料的保健食品中腺苷的測(cè)定用HPLC方法，用藥典或《規(guī)范》中的方法測(cè)定蟲草類制品中腺苷含量時(shí)結(jié)果偏低，上述方法均單一檢測(cè)蟲草中腺苷或蟲草素。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116-2012可同時(shí)檢測(cè)蟲草中腺苷和蟲草素，但提取時(shí)間過長(zhǎng)。近年來國內(nèi)采用高效液相色譜法測(cè)定蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量的報(bào)道較多，腺苷和蟲草素等核苷類成分是蟲草的主要功效成分，因此對(duì)這2種成分的檢測(cè)尤為重要。本研究目的是盡量簡(jiǎn)化樣品前處理步驟，避免使用有毒有機(jī)溶劑，優(yōu)化HPLC方法，建立同時(shí)測(cè)定蟲草制品中腺苷和蟲草素的HPLC方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究室內(nèi)試驗(yàn)在江蘇無錫進(jìn)行。

1.2儀器與試劑

戴安UltiMate3000高效液相色譜儀，UltiMate3000紫外檢測(cè)器，Chromeleon色譜工作站；KQ-100B超聲波清洗器，腺苷、蟲草素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取腺苷對(duì)照品0.0190g，用流動(dòng)相溶解并定容至25mL容量瓶，稱取蟲草素對(duì)照品0.0160g用流動(dòng)相溶解并定容至50mL容量瓶，分別配制成含腺苷0.76mg/mL和蟲草素0.32mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)液：分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于10mL容量瓶中，水定容至刻度，配制成含腺苷76μg/mL和蟲草素32μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：將混合標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋分別配制成腺苷濃度為2.375、4.75、9.5、19、38μg/mL，蟲草素濃度為1、2、4、8、16μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2樣品的前處理 將蛹蟲草制品混和均勻，精確稱取樣品1.0g于50mL離心管中，加入25mL提取液后超聲提取，提取結(jié)束后用提取液定容至刻度，混勻后以10000vpm離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后供液相色譜分析用。

1.3.3色譜條件 色譜柱為C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）流動(dòng)相：水-甲醇（85：15，V/V）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇 中國藥典中用90%甲醇加熱回流提取，《規(guī)范》中用60%乙醇提取，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中用水提取，筆者分別比較了同等處理?xiàng)l件下，水、60%乙醇、90%甲醇、100%乙醇5種溶劑提取效果，結(jié)果顯示以水提取效果最好，檢測(cè)結(jié)果見表1。

由表1可知，所測(cè)樣品中腺苷和蟲草素含量均隨提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低，用水提取的含量最高，這與農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)使用的提取溶劑一致。

2.1.2提取時(shí)間的選擇 同一個(gè)樣品，用水作為提取劑，分別超聲提取10、40、80、180min，結(jié)果見表2。

由表2可知，在水做提取溶劑的條件下，提取時(shí)間短則提取不完全，超聲40min時(shí)蟲草素含量達(dá)到最大，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)提取效果沒有增加，所以提取時(shí)間定為40min。

2.2液相色譜條件的選擇

2.2.1流動(dòng)相的選擇 中國藥典和《規(guī)范》中選用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動(dòng)相，而長(zhǎng)期使用鹽相會(huì)減少色譜柱的使用壽命，從而增加檢測(cè)成本。農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中選用乙腈-水（5：95，V/V）作為流動(dòng)相，考慮到乙腈的毒性較大，筆者采用不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相，對(duì)腺苷和蟲草素的分離效果進(jìn)行比較，最終確定甲醇-水（15：85，V/V）為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，在此條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中腺苷和蟲草素能得到很好分離，色譜圖見圖1，樣品圖譜中腺苷和蟲草素的保留時(shí)間與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致，并且與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取腺苷和蟲草素對(duì)照品溶液在200-400mm進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)腺苷和蟲草素的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限 將標(biāo)準(zhǔn)系列依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為20μL，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行線性回歸，得腺苷標(biāo)準(zhǔn)系列（2.375～38μg/mL）的回歸方程為：Y=0.981X+0.2074，r=1；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)系列（1.00～32.0μg/mL）的回歸方程為：Y=0.9795X+0.0806，r=1。腺苷和蟲草素在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)定色譜峰達(dá)到3倍信噪比時(shí)，對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為檢出限；達(dá)到10倍信噪比時(shí)，對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為定量限。即本方法檢出限為0.2μg/mL，定量限1.0μg/mL。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn) 取6份平行樣品，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果樣品中腺苷、蟲草素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為227、74.5mg/100g，RSD分別為1.12%和1.35%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 樣品用水超聲提取40min后，分別放置0、4、8、12、24h后進(jìn)樣，測(cè)定腺苷、蟲草素的峰面積，結(jié)果腺苷、蟲草素的峰面積的RSD分別為2.12%和1.56%，表明試驗(yàn)提取的溶液，腺苷和蟲草素的含量在24h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.3.4方法準(zhǔn)確度及精密度 取已知含量的3種蟲草制品，按照1.3.2章節(jié)下提到的方法處理，在1.3.3條件下測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)樣品每個(gè)添加水平取平行樣3份，計(jì)算方法回收率和精密度，結(jié)果見表3。加標(biāo)回收率在94%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。說明該方法加標(biāo)回收效果較好，適合于蟲草制品含量測(cè)定。

3討論

農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法可以很好地分離蟲草素和腺苷，但是需要用水超聲提取3h，耗時(shí)較長(zhǎng)，本試驗(yàn)對(duì)不同提取時(shí)間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取40min后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)腺苷蟲草素含量沒有提高。

《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版和中國藥典2010版冬蟲夏草項(xiàng)下腺苷含量測(cè)定，都采用磷酸鹽溶液與甲醇的混合體系作為流動(dòng)相，作者比較幾種流動(dòng)相分離效果，水-甲醇（85：15，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)樣品中腺苷和蟲草素的色譜峰分離度大于1.5，能夠得到很好地效果，同時(shí)此流動(dòng)相避免磷酸鹽對(duì)色譜柱的損傷。本研究建立的液相色譜方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高，適合于蟲草制品中腺苷和蟲草素定性定量分析。