褚鑫 胡曙華 王國棟 熊金富 程鵬飛 蔡恩麗
【摘要】目的:探討哈尼族驗方“莫那奇”對大鼠腦出血(ICH)后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)陽性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用。方法:40只SD大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組和莫那奇組各10只,以自體血注入法建立大鼠ICH模型,以Berderson評分法對其神經(jīng)缺損體征進(jìn)行評分,應(yīng)用原位雜交方法檢測干預(yù)后BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的變化。結(jié)果:與模型組比較,莫那奇組大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度恢復(fù),腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。空白組和假手術(shù)組基本無陽性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論:哈尼族驗方“莫那奇”促進(jìn)神經(jīng)缺損體征恢復(fù)和腦組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的增加可能是其治療腦出血后神經(jīng)損傷的重要機制之一。
【關(guān)鍵詞】哈尼族;BDNF;腦出血;腦組織修復(fù)
【中圖分類號】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號】1007-8517(2015)23-0003-02
腦出血(intra cerebral hemorrhage,ICH)是指原發(fā)性腦實質(zhì)的非創(chuàng)傷性出血,是臨床常見的腦血管疾病。ICH后腦損傷的緩解和治療是臨床實踐中重要的環(huán)節(jié)[1],在降低患者致殘率和死亡率、改善患者生活質(zhì)量方面起重要作用。哈尼族驗方“莫那奇”在長期臨床治療ICH中效果顯著,本實驗以ICH大鼠模型作為治療對象,探討“莫那奇”對大鼠腦出血(ICH)后神經(jīng)缺損體征及腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)陽性細(xì)胞數(shù)的干預(yù)作用,以揭示其治療ICH的作用機理。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組 健康成年昆明種SD大鼠40只,雌雄各20只,體重在220~240g,由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,動物質(zhì)量合格證書號:SCXK(滇)2011-0004。隨機分為四組:正常組、假手術(shù)、模型組、莫那奇組各10只。實驗前動物先在實驗室適應(yīng)環(huán)境2周,常規(guī)飼養(yǎng),體重達(dá)到250~280g時開始造模;造模前禁食12h,禁水6h;實驗中,剔除死亡和不合格者,及時追加動物以補充模型。
1.2 儀器設(shè)備與試劑 腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司);石蠟切片機(LEICA,德國);光學(xué)顯微鏡(LEICA,德國);手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司);乙醇(成都化學(xué)試劑廠,分析純AR);水合氯醛(上海試劑公司,分析純AR),0.1 M PBS(NaCl 9g+NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸餾水至1000ml);0.1%DEPC溶液(lmlDEPC+999mlPBS);4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2~7.6)(多聚甲醛40g+0.1%DEPC溶液至1000ml);BDNF原位雜交試劑盒(武漢博士德公司);莫那奇湯(老虎刺皮、黑皮跌打、山皮條、滿山香、藤蕉、大荃麻、松節(jié)、楊梅皮、天紅地綠等各9g,濃度為1200g生藥/L)。
1.3 ICH模型的制備和篩選 手術(shù)器械消毒備用,參照并改進(jìn)Rosenberg等[2]報道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后,采用Berderson[3]評分法,篩選成功模型動物。根據(jù)Berderson神經(jīng)體征評分法:輕抓尾巴,提起高于桌面10cm,正常大鼠前爪伸直。0分:無神經(jīng)功能缺損;1分:腦部病變對側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲,肩內(nèi)收屈曲;2分:上述體征陽性,向麻痹側(cè)推阻力下降;3分:活動時向麻痹側(cè)打圈(呈追尾狀)。分?jǐn)?shù)在1分以上(包括1分)即為造模成功。
1.4 各組實驗動物干預(yù)方法 空白組:10只大鼠,不做任何手術(shù)處理,常規(guī)飼養(yǎng),每日灌胃生理鹽水1ml,每日1次,連續(xù)3d。假手術(shù)組:10只大鼠,分別用10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉,俯臥位固定于立體定位儀上,術(shù)中微量注射器沿鉆孔進(jìn)針約6mm,留針約7min,緩慢出針,處理創(chuàng)面,清醒后常規(guī)飼養(yǎng),每日灌胃生理鹽水1ml,每日1次,連續(xù)3d。模型組:10只,造模后不治療,常規(guī)飼養(yǎng),每日灌胃生理鹽水1ml,每日1次,連續(xù)3d。莫那奇組:每日按生藥4.5g/kg體重/d給予莫那奇湯灌胃,每日1次,連續(xù)3d。各組大鼠在造模3d后重新進(jìn)行Berderson神經(jīng)體征評分。
1.5 標(biāo)本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉,順序灌注生理鹽水和4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2~7.4)各約200ml,灌注完畢后在冰浴中快速開顱并取出完整腦,距注射針孔前后各約2mm冠狀切開,將標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定。
1.6 制作石蠟切片 固定腦組織30~40min后沖水2~3h,脫水透明(將腦組織依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇過夜、95%乙醇2h、無水乙醇Ⅰ0.5h、無水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min),浸蠟(將腦組織依次浸入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ各2h),包埋后切片(片厚5μm)。將切片放入60℃烤箱2h。
1.7 原位雜交檢測BDNF 石蠟切片常規(guī)脫蠟,滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶,后固定,預(yù)雜交,雜交,洗滌,滴加封閉液,滴加生物素化鼠抗地高辛,滴加SABC,滴加生物素化過氧化物酶,DAB顯色,必要時蘇木素復(fù)染,充分水洗,脫水,透明,封片。
1.8 圖像分析 利用病理圖像分析軟件,在400倍光鏡下,隨機選取每張切片ICH血腫周邊5個不同視野,陽性細(xì)胞呈褐色或棕黃色,區(qū)分各切片所選視野內(nèi)陽性細(xì)胞并計數(shù)。
1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 使用統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組數(shù)據(jù)用x±s表示,各組間比較采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA),方差齊時選用LSD法,方差不齊時選擇秩和檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 各組大鼠Berderson神經(jīng)體征評分比較 莫那奇組、模型組大鼠均表現(xiàn)不同程度的出血對側(cè)偏癱,莫那奇組與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)??瞻捉M和假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能異常。見表1。
2.2 各組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)的比較 莫那奇組、模型組分別與空白組、假手術(shù)組進(jìn)行比較,BDNF陽性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,莫那奇組大鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)??瞻捉M和假手術(shù)組基本無陽性表達(dá)細(xì)胞。見表2。
3 討論
腦出血是中老年人多發(fā)病種,起因復(fù)雜,病理機制尚不明確,并發(fā)癥和后遺癥多,其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率給病患生活帶來極大困擾,因此也是廣大醫(yī)務(wù)工作者和基礎(chǔ)科研的重點研究對象。
臨床上腦出血急性期多采用手術(shù)療法,如開顱清除血腫、降顱壓、穿刺抽吸血腫、血性腦液引流等,一般療法包括吸氧、控制血壓、降溫、防治并發(fā)癥等輔助措施,但老年人由于體質(zhì)弱、耐受差、術(shù)后易感染,不宜施行手術(shù),因此尋找安全有效的療法對中老年患者十分必要。傳統(tǒng)醫(yī)藥治療腦出血有豐富的經(jīng)驗積累,能有效減輕出血后腦組織損傷程度,提高患者生活質(zhì)量,目前應(yīng)用較多的傳統(tǒng)方法多為中草藥制劑,如川芎嗪、羚角鉤藤湯、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯等[4]。
哈尼族醫(yī)藥作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分,已有數(shù)千年的發(fā)展歷史,其以多樣的療法和顯著的療效,有力地保障了哈尼族的文明延續(xù),備受哈尼人民尊重。墨江縣委黨校醫(yī)務(wù)室胡氏之“莫那奇”,哈尼族用語,意為“中風(fēng)、風(fēng)濕麻木很好的藥”。莫那奇由哈尼族民族民間草藥為主組成:老虎刺皮(駱銘傲割阿孜)、黑皮跌打(啊納呃積赤)、山皮條(呃殼呃積)、滿山香(約茅膩)、藤蕉(札柯倍都耶)、大荃麻(和茄榪)、松節(jié)(托自阿尼)、楊梅皮(昔切呃積)、天紅地綠(咪呢秘尼)等(括號內(nèi)藥名為哈尼用語)。主要功效為活血化瘀、行氣止痛、通經(jīng)活絡(luò)。其中天紅地綠、滿山香、藤焦等辛辣芳香,為健脾理氣之品,能行氣活血;黑皮跌打、楊梅皮、老虎刺皮、山皮條等有活血止血的功效。哈尼醫(yī)藥與中醫(yī)藥理論有許多相通和相似之處,為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其研究提供了很好的契機。研究表明,腦出血后腦內(nèi)瘀血、水腫、血紅蛋白毒性、繼發(fā)性腦缺血等多種因素致使胞內(nèi)凋亡信號通路激活,氧自由基增加,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[5],廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中,有促進(jìn)神經(jīng)元生長發(fā)育、保護(hù)和修復(fù)損傷的作用[6-7]。生理狀態(tài)下BDNF陽性細(xì)胞表達(dá)較少,ICH出血灶周圍組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多,BDNF表達(dá)上升,其受體TrkB與BDNF表達(dá)協(xié)同上調(diào),有實驗證實,BDNF通過激活其受體TrkB,阻斷胞內(nèi)損傷因子對蛋白激酶C的失活,來防止神經(jīng)元發(fā)生變性、死亡[8]。石秋艷等[9]研究發(fā)現(xiàn),ICH后誘導(dǎo)BDNF蛋白表達(dá),有利于對損傷NCs的保護(hù)和修復(fù)。本實驗中,莫那奇湯組與對照組相比,大鼠神經(jīng)缺損體征有一定程度的恢復(fù),有統(tǒng)計學(xué)意義,腦出血病灶周圍組織中BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量增加顯著,由此推斷,莫那奇湯促進(jìn)腦組織BDNF的表達(dá),有利于損傷神經(jīng)元的保護(hù)和修復(fù),可能是其治療腦出血的機制之一。
參考文獻(xiàn)
[1]皮志杰. 腦出血的病因病理變化及治療進(jìn)展[J]. 咸寧學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009(05): 457-458.
[2]Gary A Rosenberg,S Mun-Bryce,M Wesley,et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990,21(5): 801.
[3]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3): 472.
[4]焦健,徐淑娜.羚羊鉤藤湯臨證加減治療高齡腦出血患者臨床研究[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2015(07):21-23.
[5]Schabitz WR,Steigleder T,Cooper-Kuhn CM,et al.Intravenous brain-derived neurotrophic factor enhances poststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis[J]. Stroke,2007, 38(7): 2165-2172.
[6]Melina L Willsom,Catriona Mcelnea,Jean Mariani,et al.BDNF increases homotypic olivocerebellar reinnervation and associated fine motor and cognitive skill[J]. Brain,2008, 131(4): 1099-1112.
[7]Xing-Yun Song,F(xiàn)ang Li,F(xiàn)eng-He Zhang,et al. Peripherally-derived BDNF promotes regeneration of ascending sensory neurons after spinal cord injury[J]. Pl One,2008, 3(3): 1707.
[8]周暉,毛萌.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對缺氧胚鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].華西醫(yī)大學(xué)報,2002,33(4):573-576.
[9]石秋艷,何俊芳,孫惠芳. 腦出血大鼠腦內(nèi) NGF 和 BDNF 蛋白表達(dá)變化的研究[J]. 中國醫(yī)藥指南,2010(07): 8-10.
(收稿日期:2015.10.12)