陳維中，蔡靖斌，陳曉蘭，陳瑞奇，李夏靜，廖聯(lián)明（．南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建莆田3500；．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院腫瘤研究所，福建福州35008）

漢黃芩素與氟尿嘧啶聯(lián)用抗人肝癌細(xì)胞Hep-G2作用的拮抗效應(yīng)研究

陳維中1，蔡靖斌1，陳曉蘭1，陳瑞奇2，李夏靜2，廖聯(lián)明2（1．南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，福建莆田351100；2．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院腫瘤研究所，福建福州350108）

目的探討漢黃芩素（wogonin）聯(lián)合氟尿嘧啶（5-FU）對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2生長(zhǎng)活性的影響。方法實(shí)驗(yàn)分漢黃芩素組、5-FU組、漢黃芩素＋5-FU組和空白對(duì)照組，采用MTT法觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性的影響，采用流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示漢黃芩素（5、10、20、40μmol／L）作用24、48 h后對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用（P＜0.05）；5-FU（5、10、20、40 mg／L）作用24、48 h后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05）；與單用組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用相比，漢黃芩素聯(lián)合5-FU組的抗腫瘤作用呈相互拮抗作用（P＜0.05）；漢黃芩素聯(lián)合5-FU給藥48 h后，聯(lián)合指數(shù)CI值呈現(xiàn)劑量依賴性，CI值隨漢黃芩素濃度的加大而增大，說(shuō)明隨漢黃芩素濃度的加大，其拮抗5-FU抗腫瘤效應(yīng)的作用也越來(lái)越明顯（P＜0.05）。結(jié)論漢黃芩素具有一定的抗腫瘤作用，但可拮抗5-FU的抗腫瘤作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

漢黃芩素；氟尿嘧啶；拮抗作用；肝癌細(xì)胞Hep-G2

漢黃芩素（圖1）是一種從黃芩（唇形科）中提取的天然黃酮類(lèi)化合物，其抗腫瘤作用越來(lái)越引起學(xué)者的重視［1］；臨床常運(yùn)用5-FU治療實(shí)體瘤，但易產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用，故聯(lián)合用藥增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)并減輕其毒副作用成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。但值得關(guān)注的是研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥也可能產(chǎn)生一定的相互拮抗作用［2］。本研究在觀察漢黃芩素聯(lián)合5-FU的抗腫瘤作用時(shí)發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用存在一定的拮抗作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1．1藥物及試劑 漢黃芩素由福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院腫瘤研究所制備，用二甲基亞砜（DMSO）溶液配制成濃度為200μmol／L的母液，分裝，儲(chǔ)存于－20℃冰箱，備用；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自凱基生物試劑公司。

圖1 漢黃芩素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1．2細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞Hep-G2培養(yǎng)于10%胎牛血清，1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)（37℃培養(yǎng)箱，5%CO2）。

1．3細(xì)胞增殖活力檢測(cè)（M TT法） 取2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl，培養(yǎng)24 h后給藥，分為漢黃芩素組（5、10、20、40μmol／L）、5-FU組（5、10、20、40 mg／L）、聯(lián)合給藥組和空白對(duì)照組。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。藥物分別作用24及48 h后，棄培養(yǎng)液。每孔加入100μl 0.5%MTT溶液并在培養(yǎng)箱中作用4 h，傾去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液100μl，待完全溶解顯色后，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1．4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用顯微鏡分別觀察漢黃芩素（40μmol／L）和5-FU（5 mg／L）處理Hep-G2細(xì)胞48 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1．5細(xì)胞凋亡率檢測(cè)（流式細(xì)胞術(shù)） 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、漢黃芩素（20μmol／L）組、5-FU（5 mg／L）組、聯(lián)合給藥組（漢黃芩素20μmol／L＋5-FU 5 mg／L）4個(gè)組，給藥處理Hep-G2細(xì)胞24 h，磷酸緩沖液（PBS）洗滌2次，用不含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的胰酶消化，收集1×105個(gè)細(xì)胞，加入500μl的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再加入5μl磷酯酰絲氨酸-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 m in，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1．6聯(lián)合組給藥48 h的聯(lián)合指數(shù)CI計(jì)算方法參照相關(guān)文獻(xiàn)［3-5］：聯(lián)合指數(shù)CI＝D1／（DX）1＋D2／（DX）2。首先計(jì)算漢黃芩素和5-FU的IC50所對(duì)應(yīng)的濃度，（DX）1代表漢黃芩素作用48 h，IC50所對(duì)應(yīng)的漢黃芩素濃度，（DX）2代表5-FU作用48 h，IC50所對(duì)應(yīng)的5-FU濃度。其次計(jì)算聯(lián)用組C1［漢黃芩素（5μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］、C2［漢黃芩素（10μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40mg／L）］、C3［漢黃芩素（20μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］、C4［漢黃芩素（40μmol／L）＋5-FU（5、10、20、40 mg／L）］48 h給藥處理，IC50所對(duì)應(yīng)的漢黃芩素和5-FU的濃度。D1代表聯(lián)合給藥組IC50所對(duì)應(yīng)的漢黃芩素給藥濃度，D2代表聯(lián)合給藥組IC50所對(duì)應(yīng)的5-FU的給藥濃度。將所得的值代入上述公式得到CI值。當(dāng)CI＜1，表明具有協(xié)同作用；當(dāng)CI＝1，表明具有相加作用；當(dāng)CI＞1，表明具有拮抗作用。

1．7數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各均數(shù)間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1漢黃芩素對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果表明，漢黃芩素給藥處理24、48 h后，漢黃芩素對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2增殖具有一定的抑制作用，其抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，見(jiàn)圖2、3。

圖2 漢黃芩素給藥24 h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率

圖3 漢黃芩素給藥48 h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率

2.2漢黃芩素對(duì)Hep-G2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 漢黃芩素給藥48 h，形態(tài)學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓，體積縮小，細(xì)胞變形，并伴有壞死細(xì)胞及碎片，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

2．35-FU對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖的抑制作用 5-

FU給藥處理24、48 h后，5-FU對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2具有明顯抑制作用，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，見(jiàn)圖4、5。

2．45-FU對(duì)Hep-G2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 形態(tài)學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓，體積縮小，細(xì)胞變形，并伴有壞死細(xì)胞及碎片，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

2．5聯(lián)合給藥處理24、48h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制作用 聯(lián)用組對(duì)Hep-G2抑制率小于單用組抑制率之和，說(shuō)明漢黃芩素聯(lián)合5-FU抗人肝癌細(xì)胞Hep-G2具有一定的拮抗作用（P＜0.05，見(jiàn)表1、2）。漢黃芩素聯(lián)合5-FU給藥48h，其聯(lián)合用藥指數(shù)CI值呈現(xiàn)劑量依賴性，CI值隨著漢黃芩素濃度的加大而增大，說(shuō)明隨著漢黃芩素濃度的加大，其拮抗5-FU抗腫瘤效應(yīng)越明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖4 5-FU給藥24h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率

圖5 5-FU給藥48h對(duì)Hep-G2 細(xì)胞增殖抑制率

圖6 不同劑量漢黃芩素聯(lián)合5-FU 給藥48h對(duì)聯(lián)合指數(shù)影響

表1 聯(lián)用組給藥處理24h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n＝8）

表1 聯(lián)用組給藥處理24h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n＝8）

漢黃芩素濃度（cB／μmol?L－1）5-FU濃度（ρB／mg?L－1）0 5 102040 0 0 25．35±0．1830．71±0．4034．99±0．4237．62±0．43 5 2．53±0．7524．52±0．1830．72±0．0633．63±0．7136．43±0．90 103．88±0．0725．70±0．1131．96±0．0833．26±0．0938．10±0．75 2010．67±0．5626．50±0．2630．21±0．1432．69±0．0935．98±0．09 4014．52±0．3128．43±0．0832．64±0．0732．67±0．2230．85±0．05

表2 聯(lián)用組給藥處理48h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n＝8）

表2 聯(lián)用組給藥處理48h對(duì)Hep-G2細(xì)胞增殖抑制率（±s，n＝8）

漢黃芩素濃度（cB／μmol?L－1）5-FU濃度（ρB／mg?L－1）0 5 102040 0 0 48．93±0．0852．38±0．1457．86±0．0967．50±0．02 5 8．10±0．5748．02±0．0448．42±0．0856．73±0．2560．55±0．09 109．74±0．1347．29±0．3549．47±0．1755．90±0．0863．20±0．20 2016．21±0．0645．46±0．1146．17±0．2554．89±0．0563．95±0．08 4024．88±0．1543．77±0．3545．96±0．1055．93±0．0764．06±0．04

2．6聯(lián)合給藥處理24h對(duì)Hep-G2細(xì)胞凋亡的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率之和小于單用組細(xì)胞凋亡率之和，1＋1＜2，說(shuō)明漢黃芩素對(duì)5-FU抗腫瘤效應(yīng)具有一定的拮抗作用，見(jiàn)圖7。

3 討論

5-FU在臨床上應(yīng)用較為廣泛，對(duì)消化道腫瘤及其他實(shí)體瘤有良好療效，在腫瘤內(nèi)科治療中占有重要地位，但其在治療劑量范圍內(nèi)存在著嚴(yán)重的毒副作用，如：胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制導(dǎo)致的白細(xì)胞及血小板減少、脫發(fā)等。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察5-FU對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2的增殖抑制作用，證實(shí)其對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2具有明顯的抑制作用，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察，其誘導(dǎo)了Hep-G2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生一定的影響，說(shuō)明5-FU對(duì)Hep-G2有顯著的增殖抑制效應(yīng)。漢黃芩素具有一定的抗氧化作用及神經(jīng)保護(hù)作用，可以降低氧活性自由基的表達(dá)［6］，漢黃芩素作用于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生［7］，并激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；漢黃芩素還可作用于腫瘤細(xì)胞PI3KAKT信號(hào)通路［8-10］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明具有一定的抗癌作用。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察漢黃芩素對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞Hep-G2具有一定的抑制作用，同時(shí)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上觀察，可誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞凋亡，說(shuō)明漢黃芩素對(duì)Hep-G2有一定的增殖抑制作用。

圖7 不同給藥組處理24 h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

雖然漢黃芩素在體外具有一定的抗腫瘤作用，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示漢黃芩素有拮抗5-FU的抗腫瘤效應(yīng)，細(xì)胞增殖活力檢測(cè)（MTT法）和細(xì)胞凋亡檢測(cè)（流式細(xì)胞術(shù)）發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給藥組對(duì)Hep-G2抑制率小于兩藥單用抑制率之和，表明漢黃芩素聯(lián)合5-FU抗人肝癌細(xì)胞Hep-G2具有一定的拮抗作用，漢黃芩素聯(lián)合5-FU給藥48 h，聯(lián)合指數(shù)CI＞1，隨著其濃度加大，CI變大，拮抗作用越明顯，說(shuō)明漢黃芩素與5-FU聯(lián)合用藥不但不能提升療效，反而可能增加5-FU的毒副作用，漢黃芩素拮抗5-FU的抗腫瘤作用機(jī)制有待深入研究。

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Combination ofwogonin w ith 5-fluorouracilexhibits antagonistic effecton human Hep-G2 hepatocellular carcinoma cells

CHENWeizhong1，CAIJingbin1，CHEN Xiaolan1，CHEN Ruiqi2，LIXiajing2，LIAO Lianming2（1．First Affiliated Hospital，F(xiàn)uzhou General Hospitalof Nanjing M ilitary Region，Putian 351100，China；2．Departmentof Oncology，Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China）

ObjectiveTo investigate the antagonistic effect of wogonin in combination w ith 5-fluorouracil（5-FU）on the proliferation of human Hep-G2 hepatocellular carcinoma cells．MethodsHuman hepatocellular Hep-G2 cellswere divided into experimental group（wogonin group，5-FU group，wogonin＋5-FU group）and controlgroup．MTTmethod was used to evaluate tumor cell proliferation in vitro，flow cytometry analysiswas used to evaluate tumor cell apoptosis．ResultsThe results showed that the wogonin inhibited the proliferation of tumor cells at the concentrations of 5，10，20 and 40μmol／L after 24 h and 48 h treatment respectively（P＜0.05）；5-FU also inhibited the proliferation of tumor cells at the concentrations of 5，10，20 and 40 mg／L after 24 h and 48 h treatment respectively（P＜0.05）．However when wogonin was combined w ith 5-FU（wogonin＋5-FU group），an antagonistic effect was observed on tumor cell proliferation（P＜0.05）．When cells were treated by wogonin＋5-FU for 48 h，the combined index（CI）value slowed a dose-dependentantagonistic effect（P＜0.05）．ConclusionWogonin has anti-tumor effect．However when wogonin was combined w ith 5-FU，an obvious antagonistic effect on 5-FU′s anti-tumor action was observed．The underlyingmechanism deserves further study．

wogonin；fluorouracil；antagonism；hepatocellular carcinoma cell Hep-G2

R979．1

A

1006-0111（2015）05-0411-04

10．3969／j．issn．1006-0111．2015．05．007

2014-11-20

2015-07-09

［本文編輯］ 陳 靜

陳維中，本科，副主任藥師．研究方向：醫(yī)院藥學(xué)．E-mail：cwzhongfz＠sina．com

廖聯(lián)明，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師．研究方向：中藥抗腫瘤的藥理學(xué)機(jī)制．E-mail：llm＠fjtcm．edu．cn