盛康亮，李 影，付靜靜，陳鏡宇，張玲玲，魏偉

◇基礎(chǔ)醫(yī)學研究◇

PGE2對LPS誘導小鼠骨髓源性樹突細胞成熟及EP4受體表達影響

盛康亮*，李 影*，付靜靜，陳鏡宇，張玲玲，魏偉

目的觀察不同濃度前列腺素E2（PGE2）刺激對脂多糖（LPS）誘導小鼠骨髓源性樹突細胞（DCs）成熟及EP4受體表達的影響。方法采用重組小鼠粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細胞介素4（rmIL-4）刺激小鼠骨髓源細胞，誘導生成DCs；經(jīng)LPS（100 ng／ml）誘導成熟后，用不同濃度PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激DCs 24 h，流式細胞術(shù)檢測DCs表型CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達和抗原攝取功能，熒光間標法檢測小鼠骨髓源DCs細胞膜上EP4的表達，以平均熒光強度表示表達的高低；MTT法檢測經(jīng)PGE2及LPS誘導成熟的DCs對T細胞增殖的作用。結(jié)果流式細胞術(shù)結(jié)果顯示PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）能明顯上調(diào)CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達；PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）能明顯抑制DCs的抗原攝取功能；MTT法檢測結(jié)果顯示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激DCs能促進T細胞增殖的作用；熒光間標法檢測結(jié)果顯示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）明顯升高DCs細胞膜上EP4表達。結(jié)論PGE2可以調(diào)節(jié)DCs功能，該作用可能與其調(diào)節(jié)EP4受體表達相關(guān)。

EP4受體；樹突細胞；PGE2

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是花生四烯酸類物質(zhì)的重要代謝產(chǎn)物，具有較強的免疫活性，可以調(diào)節(jié)免疫細胞的發(fā)育、功能以及存活［1］。前列腺素E2受體（E-prostanoid receptors，EPs）分為4個亞型，即EP1、EP2、EP3和EP4。EP2和EP4受體通過偶聯(lián)Gs蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而增加細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的水平［2］。PGE2與其不同EP受體結(jié)合，促進了白細胞介素（interleukin）6和組胺的釋放，影響血管的通透性，導致炎癥的發(fā)生［3］。研究［4］顯示多數(shù)免疫細胞均表達EP受體。但研究［5］多集中在巨噬細胞、T淋巴細胞及B淋巴細胞。樹突細胞（dendritic cells，DCs）作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的專職抗原遞呈細胞，在參與免疫反應中起重要作用［6］。研究［7］報道，體外培養(yǎng)DCs能產(chǎn)生花生四烯酸產(chǎn)物，特別是PGE2。另有報道［8］PGE2主要通過EP4調(diào)節(jié)DCs的功能。但不同濃度PGE2對DCs成熟有怎樣的調(diào)節(jié)作用，其對DCs成熟的調(diào)節(jié)是否通過影響EP4受體的表達來發(fā)揮作用，目前未見相關(guān)研究。該研究觀察不同濃度PGE2對DCs功能的影響以及與EP4表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級健康C57BL／6小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，7～8周齡，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，標準化清潔環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑重組小鼠白細胞介素4（recombinant IL-4，rmIL-4）、重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子（rm granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）、FITC標記的羊抗兔二抗購自美國Pepretech公司；RPMI-1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；紅細胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；PE標記的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型對照IgG購自美國Biolegend公司；EP4受體一抗購自美國Santa公司；；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、FITC-Dextran（40 ku）購自美國Sigma公司。

1.3 DCs的分離與培養(yǎng)小鼠脫臼處死后，在超凈臺無菌條件下分離小鼠后肢股骨和脛骨，75%酒精浸泡3 min，用5 ml注射器用PBS反復洗2次；去除骨兩端，用5 ml注射器抽取滅菌后的PBS液反復沖洗出骨髓直至骨髓腔變白；用200目紗網(wǎng)過濾沖洗出的骨髓懸液，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，根據(jù)骨髓細胞數(shù)量，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640，細胞數(shù)量調(diào)整到5×109／L；鋪在6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，使得細胞貼壁，3 h更換新鮮培養(yǎng)基，并加入rmGMCSF（終濃度20 μg／L）和rmIL-4（終濃度20 μg／L）；于第3、5天，隔日半量換液，棄去半量上清液，重新加入含10%胎牛血清和rmGM-CSF（20 μg／L）、rmIL-4（20 μg／L）的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第6天，吹打、收集粘附的細胞，采用流式細胞儀檢測相關(guān)指標［4］。

1.4 DCs的鑒定

1.4.1 形態(tài)學及DCs細胞表型的鑒定 細胞培養(yǎng)至第3、5、7天，分別鏡下觀察細胞是否具有成簇生長、突起、毛刺等樹突細胞特征。收集培養(yǎng)至第7天的細胞，輕輕吹打，收集粘附的細胞，2 000 r／min離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細胞數(shù)量5×106／ml，加入流式管中，每管100 μl。分別加入FITC標記的CD11c（小鼠DCs特異性表面標記物）抗體及同型對照抗體，4℃孵育30 min后，再加入300 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。檢測CD11c細胞比例，鑒定DCs并確定相關(guān)培養(yǎng)條件。

1.4.2 對DCs的干預 培養(yǎng)至第6天，根據(jù)實驗需要，設(shè)空白對照組、陽性對照組LPS（100 ng／ml）、處理組PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）＋LPS（100 ng／ml），24 h后收集DCs檢測相關(guān)指標。

1.5 DCs的表型及功能檢測

1.5.1 骨髓源DCs表型和EP4表達的檢測 細胞培養(yǎng)至第7天，輕輕吹打、收集粘附的細胞，2 000 r／min離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細胞數(shù)量5×106／ml，每管100 μl。DCs表型檢測每管細胞分別加入PE標記的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型對照IgG，EP4表達的檢測每管細胞加入兔源性抗EP4受體一抗（1∶100），孵育，PBS洗滌，加FITC標記的羊抗兔二抗（1∶250）避光孵育，用僅加入FITC標記的羊抗兔二抗孵育的DCs作為同型對照。4℃避光孵育30 min后，加入300 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。去除非特異性染色后，比較平均熒光強度的變化。流式細胞儀檢測，以X軸平均熒光強度的變化表示DCs表型的表達。

1.5.2 DCs攝取功能的檢測 細胞培養(yǎng)至第7天，輕輕吹打、收集粘附的細胞，2 000 r／min，離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細胞數(shù)量5×106／ml，培養(yǎng)于1.5 ml EP管中，每管100 μl，加入PBS稀釋的FITC-Dextran（終濃度為1 mg／ml），置于37℃溫育2 h后取出，PBS洗滌重懸于400 μl PBS中，流式細胞儀檢測。其他條件相同4℃孵育作為對照。以X軸平均熒光強度的變化表示DCs的吞噬能力。

1.5.3 混合淋巴細胞反應 超凈臺內(nèi)無菌條件下取小鼠脾臟，制成單細胞懸液，用紅細胞裂解液處理，除去紅細胞，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，采用尼龍毛柱法，去除細胞懸液中的B淋巴細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×106／ml，作為反應細胞。分別以培養(yǎng)至第7天的各處理組DCs為刺激細胞，以25 μg／ml的絲裂霉素C加入刺激細胞中，將其置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，滅活。將刺激細胞和反應細胞按不同比例混合，加入96孔板中，每組設(shè)3個復孔。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。MTT法分析DCs對T淋巴細胞的增殖能力的影響。預實驗結(jié)果顯示，刺激細胞和反應細胞（1∶10）比例混合具有刺激T淋巴細胞增殖的能力。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DCs的培養(yǎng)與鑒定小鼠骨髓細胞經(jīng)rmGMCSF和rmIL-4刺激，培養(yǎng)3 d后，細胞成簇生長。第5天，多數(shù)細胞呈懸浮狀，可見突起，呈毛刺狀。收集培養(yǎng)至第7天的細胞，用于后續(xù)實驗。

2.2 PGE2對DCs表型及功能的影響

2.2.1 PGE2對DCs表面分子CD40、CD83、MHC-Ⅱ表達的影響 與LPS（100 ng／ml）組比較，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）組能明顯上調(diào)CD40、MHC-Ⅱ的表達（P＜0.01）；PGE2（2.5、5 nmol／L）組能明顯上調(diào)CD83的表達（P＜0.01）；PGE2（0.625、20 nmol／L）對CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達均無明顯影響，所有劑量組對CD80均無明顯影響，見圖1。

2.2.2 PGE2對DCs抗原攝取能力的影響 與LPS （100 ng／ml）組比較，PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激組DCs的抗原攝取能力明顯降低（P ＜0.01），PGE2（0.625 nmol／L）刺激組DCs的抗原攝取能力無變化，見圖2。

2.2.3 PGE2處理的DCs對T細胞增殖的影響與LPS（100 ng／ml）組比較，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）處理的DCs能明顯增強T細胞增殖（P＜0.01），PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）處理的DCs對T細胞增殖無增強作用，見圖3。

2.2.4 PGE2對小鼠DCs表面EP4表達的影響與LPS（100 ng／ml）組比較，刺激組DCs經(jīng)較高濃度PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激后FITC平均熒光強度均顯著增強（P＜0.01），提示PGE2刺激后EP4胞膜表達明顯上升。但PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，F(xiàn)ITC平均熒光強度無明顯變化，EP4胞膜表達無明顯變化，見圖4。

3 討論

PGE2調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥性過程，如細胞因子的產(chǎn)生，抗體的形成，吞噬和細胞增殖。PGE2有促炎和抗炎雙重作用。有報道［9］PGE2通過抑制T細胞增殖和IL-2受體的表達，降低IL-2的釋放，發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，進而抑制了干擾素-γ的分泌，因此PGE2抑制輔助性T細胞1功能；但Yao et al［10］報道PGE2通過EP4受體作用于T淋巴細胞，促進輔助性T細胞1的分化和輔助性T細胞17的擴增。PGE2在不同的微環(huán)境下表現(xiàn)出對DCs功能截然不同的作用。在外周組織中PGE2對DCs有促進作用，誘導其成熟和轉(zhuǎn)移。一旦DCs轉(zhuǎn)移到淋巴器官，PGE2呈現(xiàn)抑制DCs功能，抑制其成熟及抗原的呈遞功能。此外，PGE2在不同的促炎因子及免疫細胞作用下也表現(xiàn)出對DCs功能截然不同的作用。PGE2降低IL-12并通過抑制MHCⅡ分子的表達調(diào)節(jié)抗原呈遞。PGE2可以加強DCs的分化并影響輔助性T細胞的能力。PGE2聯(lián)合促炎因子如IL-1，腫瘤壞死因子-α，IL-6等促進DCs的成熟［11］。

本研究顯示不同劑量的PGE2對DCs的功能有不同的作用，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）能促進DCs的成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）對DCs成熟沒有明顯作用。這種不同濃度的PGE2對DCs功能影響的不同，可能由于其通過不同EP受體誘導不同的細胞內(nèi)信號途徑產(chǎn)生的。實驗顯示，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）刺激后EP4胞膜表達上升，促進DCs成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，EP4胞膜表達下降，對DCs成熟無作用。研究［10］報道EP4激動劑（ONO-AE1-329）增強DCs表面CD83的表達，促進DCs成熟，而EP1和EP3無明顯作用。PGE2作用于DCs可以增強其表面分子CD83的表達，與EP4受體激動劑（ONO-AE1-329）呈現(xiàn)相似的表現(xiàn)。PGE2促進DCs成熟的作用是通過EP4受體調(diào)節(jié)這一現(xiàn)象，可以用選擇性EP4受體拮抗劑（ONO-AE3-208）作用于經(jīng)過PGE2刺激后的DCs證實。用cAMP類似物模擬PGE2的作用，表明PGE2促進DCs成熟的作用是通過cAMP調(diào)節(jié)的［12］。不僅EP4在DCs的成熟中發(fā)揮作用，還參與了T淋巴細胞功能的調(diào)節(jié)，T淋巴細胞在缺乏EP1和EP3的情況下一樣對PGE2敏感，而在缺乏EP4表達的情況下抵抗PGE2的作用［13］。PGE2通過EP4影響下游Gas蛋白的表達和cAMP水平，進而發(fā)揮促進DCs功能的作用［14］。根據(jù)這些研究推測，不同濃度PGE2對LPS誘導小鼠骨髓源性DCs成熟的差異與其調(diào)節(jié)EP4受體的表達的高低有關(guān)。

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The effect of prostaglandin E2 on maturation and EP4 expression on dendritic cell induced by LPS

Sheng Kangliang，Li Ying，F(xiàn)u Jingjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University；Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education；Co-Innovation Center for Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of PGE2 in the different concentrations on the maturation of bone marrow-derived dendritic cells（DCs）of mouse stimulated by LPS and EP4 expression.MethodsThe bone marrow-derived DCs were induced in the presence of recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor （rmGM-CSF）and rmIL-4.Maturated DCs were induced by LPS（100 ng／ml），and then were treated with PGE2 in different concentrations（0.625，1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）for 24 h.The ability of antigen uptake and the expressions of CD40，CD83 and MHC-Ⅱon DCs surface were analyzed by flow cytometry；EP4R expression was also measured by flow cytometry.T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction was analyzed by MTT assay.ResultsPGE2（2.5，5，10 nmol／L）significantly enhanced the expression of CD40，CD83，MHC class II molec-ules.However，PGE2 had no effect on CD80 expression in all of concentrations.PGE2（1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）significantly inhibited the ability of antigen uptake of DCs.DCs stimulated by PGE2（2.5，5，10 nmol／L）could promote T cell proliferation.PGE2（2.5，5，10 nmol／L）increased EP4 expression on DCs surface.ConclusionPGE2 could regulate DCs function，which might be related to EP4 receptor expression affected by PGE2.

EP4R；dendritic cells；PGE2

R 392.12

A

1000－1492（2015）07－0879－06

2015－03－16接收

國家自然科學基金（編號：81330081，31100640，81173075，81473223）；中國博士后科學基金第54批面上資助（編號：2013M540509）

安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥230032

盛康亮，男，碩士研究生；張玲玲，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：llzhang ＠ahmu.edu.cn；魏 偉，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn

*對本文具有同等貢獻