劉 琛，雷 婷，周 娟，趙夢(mèng)靜，秦宜德

乳源免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)酒精誘導(dǎo)性肝細(xì)胞損傷的干預(yù)機(jī)制

劉 琛，雷 婷，周 娟，趙夢(mèng)靜，秦宜德

目的研究乳源免疫調(diào)節(jié)肽（PGPIPN）對(duì)肝細(xì)胞酒精性脂肪變性的干預(yù)機(jī)制。方法MTT法篩選正常肝細(xì)胞株（LO2）酒精誘導(dǎo)的最佳濃度和PGPIPN最佳用藥范圍，在肝細(xì)胞內(nèi)加入酒精和不同濃度的PGPIPN進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)造模3個(gè)月，建立能穩(wěn)定遺傳的酒精誘導(dǎo)脂肪變性的肝細(xì)胞模型，觀察PGPIPN對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的防治效果。油紅O染色法觀察LO2細(xì)胞脂肪變性程度，RT-PCR法檢測(cè)脂肪合成相關(guān)基因（ACC、PPAR-γ）的表達(dá)。結(jié)果成功建立了能穩(wěn)定遺傳的酒精誘導(dǎo)脂肪變性的肝細(xì)胞模型，并篩選出酒精誘導(dǎo)LO2脂肪變性的最佳濃度和PGPIPN最佳用藥范圍。PGPIPN可以防治和緩解脂肪變性，PGPIPN可能通過降低ACC的基因表達(dá)，升高PPAR-γ的基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。結(jié)論P(yáng)GPIPN可防治和放緩肝細(xì)胞酒精性脂肪病變，機(jī)制可能是減少脂肪合成。

PGPIPN；LO2；脂肪變性；脂肪合成

資料［1］顯示男性每日攝入乙醇＞40 g，女性每日攝入乙醇＞30 g，就有可能導(dǎo)致肝臟損傷，如果任其繼續(xù)發(fā)展，可能導(dǎo)致酒精性脂肪肝，甚至肝硬化。乳源免疫調(diào)節(jié)肽（immunomodulating peptide，PGPIPN）是最典型的免疫調(diào)節(jié)肽，是位于β-酪蛋白63 ～68殘基上的6個(gè)氨基酸殘基組成的短肽［2］。研究［3］顯示PGPIPN可以減輕酒精造模小鼠脂肪變性程度，延緩酒精肝發(fā)展。該研究通過酒精誘導(dǎo)脂肪變性的肝細(xì)胞模型，旨在探討PGPIPN對(duì)酒精性脂肪肝的防治作用及對(duì)受損后肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人正常肝細(xì)胞株（LO2）由安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥物與試劑PGPIPN購自上海楚肽生物科技有限公司，純度98.23%；MTT、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選酒精最佳濃度和PGPIPN用藥濃度用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照每孔6 000、4 000、2 000個(gè)細(xì)胞種植在96孔板上，細(xì)胞貼壁后第1組使用正常培養(yǎng)基DMEM作為正常對(duì)照組，后5組細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基分別加入不同濃度酒精（0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），每日換液分別培養(yǎng)24、48、72 h后在490 nm波長下測(cè)吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞抑制率（%）＝（對(duì)照組OD490－實(shí)驗(yàn)組OD490）／對(duì)照組OD490× 100%。篩選酒精最佳濃度。再次分組第1組正常對(duì)照組使用正常培養(yǎng)基DMEM，第2組酒精對(duì)照組的DMEM培養(yǎng)基加入篩選好濃度的酒精，后5組實(shí)驗(yàn)組的DMEM培養(yǎng)基除了含有酒精還加入不同濃度的PGPIPN（1×10－5、1×10－4、1×10－3、1×10－2、1×10－1g／L），連續(xù)培養(yǎng)LO2細(xì)胞1個(gè)月，在酒精對(duì)照組LO2細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性后，取各組對(duì)數(shù)期LO2細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按照每孔6 000、4 000、2 000個(gè)細(xì)胞種植在96孔板上，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在490 nm波長下測(cè)量各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD490／酒精對(duì)照組OD490）×100%，篩選出PGPIPN最佳作用濃度。

1.3.2 酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的建立 篩選出酒精和PGPIPN最佳作用濃度后，將細(xì)胞分為：①正常對(duì)照組：DMEM培養(yǎng)；②酒精對(duì)照組：DMEM＋酒精培養(yǎng)；③低濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－4g／L）；④中濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－3g／L）；⑤高濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－2g／L）。以上各組均隔天換液，每4 d傳代，連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月后的細(xì)胞方可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 油紅O染色 取不同組別連續(xù)刺激培養(yǎng)的LO2細(xì)胞，在6孔板爬片培養(yǎng)（玻片需提前泡酸、高壓滅菌），細(xì)胞匯合率達(dá)80%后，用胰蛋白酶消化成懸液，1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌3次（60 s／次），4%多聚甲醛固定1 h，100%丙二醇洗滌2 min，避光條件下用0.5%的油紅O染色過夜，隔天用98%丙二醇洗滌5 min，85%丙二醇洗滌10 min，60%異丙醇脫色。蘇木精染色細(xì)胞核10 min，流水中藍(lán)化20 min，烘箱烘烤2 h，甘油明膠封片烘箱過夜，顯微鏡拍照。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)β-actin、乙酰輔酶A羧代酶（acetylcoA carboxylase，ACC）、過氧化物酶體增殖物活代受體γ（peroxisome proliferalors activated receptor gamma，PPAR-γ）引物序列，送至上海生工合成引物。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用Fermentas試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物PCR擴(kuò)增。瓊脂糖電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，采集圖像進(jìn)行光密度掃描，用目的基因與β-actin光密度比值衡量相應(yīng)基因表達(dá)高低，重復(fù)3次試驗(yàn)。引物序列見表1。

表1 β-actin、ACC、PPAR-γ引物序列、片段大小和退火溫度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計(jì)量資料采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 酒精誘導(dǎo)脂肪變性LO2細(xì)胞模型的建立與正常對(duì)照組比較，酒精組細(xì)胞抑制率均有上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），尤其是1.0%酒精刺激之后細(xì)胞抑制率明顯上升。表明隨著酒精濃度升高，細(xì)胞活性降低，細(xì)胞活性與酒精濃度成反比。選取0.5%的酒精濃度作為誘導(dǎo)LO2酒精性脂肪變性的最佳酒精濃度（F24 h＝158.708，F(xiàn)48 h＝113.605，F(xiàn)72 h＝176.690），見圖1。

2.2 PGPIPN對(duì)LO2細(xì)胞脂肪變性的防治作用

2.2.1 PGPIPN對(duì)酒精性脂肪變性LO2細(xì)胞存活率的影響 與正常對(duì)照組比較，各用藥組存活率均下降，除了酒精對(duì)照組和1×10－5g／L PGPIPN用藥組，其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與酒精對(duì)照組比較，加入不同濃度PGPIPN培養(yǎng)的酒精誘導(dǎo)變性肝細(xì)胞存活率均有上升，除了1×10－5g／L PGPIPN用藥組，其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以1×10－2g／L最為明顯。細(xì)胞活性在一定范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間和PGPIPN上升而增高。因此選取1×10－4、1×10－3、1×10－2g／L作為PGPIPN最佳用藥濃度（F24 h＝7.417，F(xiàn)48 h＝7.773，F(xiàn)72 h＝8.591），見圖2。

2.2.2 PGPIPN對(duì)酒精性脂肪變性LO2細(xì)胞脂肪合成的影響 油紅O染色顯示正常對(duì)照組的肝細(xì)胞沒有紅色脂肪粒，胞質(zhì)可出現(xiàn)少量未著色顆粒樣物質(zhì)；酒精對(duì)照組染色后在靠近胞膜的位置出現(xiàn)大量紅色脂滴，出現(xiàn)“環(huán)狀”或者“印戒”樣細(xì)胞，各脂滴出現(xiàn)融合現(xiàn)象；而經(jīng)過PGPIPN干預(yù)的酒精性脂肪變性肝細(xì)胞，隨著PGPIPN濃度升高出現(xiàn)脂滴減少、脂滴間融合現(xiàn)象減少，見圖3。

2.2.3 RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)基因的變化 PGPIPN可以在脂肪合成方面（圖4）下調(diào)ACC mRNA，上調(diào)PPAR-γ mRNA，且隨著PGPIPN用藥時(shí)間延長和濃度增加更加明顯，用藥組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用藥組與酒精對(duì)照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FACC＝285.170、FPPAR-γ＝183.231，P＜0.05）。

3 討論

酒精性脂肪肝在歐美等國發(fā)病率較高，但是隨著國內(nèi)生活水平和飲食習(xí)慣的改變，我國的酒精肝發(fā)病率也出現(xiàn)上升的趨勢(shì)。肝臟是酒精代謝主要場(chǎng)所，在酒精長期刺激下肝細(xì)胞容易出現(xiàn)脂肪變性，其可能的機(jī)制和脂肪代謝紊亂有關(guān)。

ACC在脂肪合成中起重要作用，是脂肪酸合成限速酶，其活性或基因表達(dá)增加可以促進(jìn)脂肪合成［4］。本實(shí)驗(yàn)證明酒精對(duì)照組的ACC表達(dá)量明顯增高；PGPIPN可以明顯下調(diào)ACC表達(dá)，且隨著PGPIPN濃度增大表達(dá)量下降更加顯著，說明在酒精的作用下，肝細(xì)胞脂肪合成增多，而PGPIPN可能通過下調(diào)ACC而減少脂質(zhì)蓄積，改善脂肪變性。

PPAR-γ屬于PPAR 3種亞型之一，在脂肪組織高表達(dá)，正常肝臟里PPAR-γ表達(dá)量?jī)H為脂肪組織的10%～30%，PPAR-γ可促進(jìn)脂肪酸在肝臟的β-氧化，起到降脂作用?；罨腜PAR-γ還能促進(jìn)細(xì)胞分泌脂聯(lián)素，其能改善肝細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性，脂聯(lián)素通過增強(qiáng)PPAR-α活性，也能促使脂肪酸β氧化，減少肝細(xì)胞脂肪堆積［5］。脂質(zhì)過氧化會(huì)降低PPAR-γ表達(dá)，促進(jìn)肝臟三酰甘油蓄積，加重肝臟脂肪變性，促進(jìn)脂肪肝形成［6］。PPAR-γ具有促進(jìn)酒精性脂肪肝細(xì)胞的分化，其活化后使轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉和肝臟的脂肪酸減少，脂肪合成降低，防止脂肪堆積［7］。該實(shí)驗(yàn)的酒精對(duì)照組脂肪變性嚴(yán)重，PPAR-γ表達(dá)量明顯降低，相反PGPIPN用藥組PPAR-γ表達(dá)量較酒精對(duì)照組有上升趨勢(shì)，且具有濃度依賴性，肝細(xì)胞脂肪變性減輕。提示PGPIPN可能通過激活PPAR-γ促進(jìn)肝細(xì)胞β-氧化，減少脂質(zhì)蓄積，改善肝細(xì)胞脂肪變性。

正常肝細(xì)胞經(jīng)過長期酒精誘導(dǎo)后脂肪生產(chǎn)增多，β-氧化減弱，脂肪酸清除減緩，脂肪堆積，造成PPAR-γ表達(dá)減弱，發(fā)生脂肪變性，而PGPIPN可以緩解酒精對(duì)PPAR-γ的抑制作用，改善酒精性脂肪變性。

酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前沒有專門藥物，主要防治手段包括戒酒、清淡飲食和加強(qiáng)鍛煉。小分子肽具有抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)抵抗力等多重作用，所以本實(shí)驗(yàn)選用PGPIPN作用于體外酒精性脂肪肝，結(jié)果顯示PGPIPN組油紅O染色脂肪合成減少，同時(shí)RT-PCR顯示ACC mRNA表達(dá)下降，PPAR-γ mRNA表達(dá)上升?？赡艿臋C(jī)制是通過降低ACC表達(dá)、激活PPAR-γ表達(dá)，減少脂肪合成，減輕脂肪變性，從而達(dá)到防治和緩解酒精性脂肪肝病變的目的，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ 鄭睿行，馬 力.免疫調(diào)節(jié)肽的概述［J］.生命科學(xué)儀器，2008，6（10）：9－12.

［2］ Wang W，Gu F，Wei C，et al.PGPIPN，a therapeutic hexapeptide，suppressed human ovarian cancer growth by targeting BCL2 ［J］.PLoS One，2013，8（4）：e60701.

［3］ 楊浩然，魏彩，唐宜桂，等.乳源免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠酒精性脂肪肝的防治作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（4）：336－40.

［4］ 彭麗紅，陽學(xué)鳳，傅 念，等.姜黃素對(duì)脂肪變性HL-7702細(xì)胞乙酰輔酶A羧化酶表達(dá)的影響［J］.中華肝臟病雜志，2008，16 （12）：948－9.

［5］ Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects［J］.Nature，2003，423（6941）：762－9.

［6］ Seo Y S，Kim J H，Jo N Y，et al.PPAR agonists treatment is effective in a nonalcoholic fatty liver disease animal model by modulating fatty-acid metabolic enzymes［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23（1）：102－9.

［7］ Eeric R K，Alan M，Scott J C.Role of peroxisome proliferatorsactivated receptors in the pathogenesis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease［J］.World J Gastroenterol，2008，14（1）：22 －8.

The effect and the mechanism of immunomodulating peptide on alcoholic fatty liver cells model

Liu Chen，Lei Ting，Zhou Juan，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effect of immunomodulating peptide（PGPIPN）on mechanism on alcoholic fatty liver cells model induced in vitro in human.MethodsThe liver cells（LO2）proliferation with the optima concentration of alcohol and PGPIPN in vitro were assayed by MTT method.Liver cells were treated with alcohol and different concentrations of PGPIPN for 3 months，then stable model of alcoholic fatty liver cells were established with screening concentration，aiming to observing the prevention and mitigation effects of PGPIPN on alcoholic fatty liver cell.Oil Red O staining was used to detect the degree of LO2cells steatosis.The expressions of genes of fat synthesis related genes（ACC，PPAR-γ）were tested by RT-PCR.ResultsAn alcohol induced fatty liver cells model was established successfully.The best concentration of alcohol and PGPIPN was already screened.PGPIPN could prevent and mitigate alcoholic fatty degeneration of the liver cells.The mechanism may be associated with decreasing expression of ACC（mRNA）and increasing expression of PPAR-γ（mRNA）induced by PGPIPN.ConclusionPGPIPN can reduce alcoholic fatty degeneration of the liver cells，which may relate to slow fat synthesis.

PGPIPN；LO2；steatosis；fat synthesis

R 332；R 392.11；R 392.12

A

1000－1492（2015）07－0892－04

2015－03－16接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81472448）

安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥230032

劉 琛，女，碩士研究生；秦宜德，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：qinyide＠hotmail.com