張 茜，王媛媛，劉麗萍，倪 芳

microRNA-1271靶向調(diào)控白血病細(xì)胞CYLD蛋白的表達(dá)

張 茜1，王媛媛1，劉麗萍1，倪 芳2

目的探討人白血病細(xì)胞中微小RNA（microRNA）-1271對(duì)CYLD蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。方法qRT-PCR檢測(cè)microRNA-1271在不同的人白血病細(xì)胞系、臨床初診未治的幾種類型原代白血病細(xì)胞、正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)差異，利用Targetscan信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)microRNA-1271靶向CYLD基因，構(gòu)建攜帶靶基因野生型及突變型3’非翻譯區(qū)（3’UTR）（缺失了整段預(yù)測(cè)的microRNA-1271結(jié)合序列）的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000包裹雙熒光素酶重組質(zhì)粒及microRNA-1271模擬物（mimic）或陰性對(duì)照，共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。FAM標(biāo)記的microRNA-1271抑制物和陰性對(duì)照分別核轉(zhuǎn)染至人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)CYLD蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果microRNA-1271在不同人白血病細(xì)胞系以及臨床初診未治的原代白血病細(xì)胞中的表達(dá)均明顯高于正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證CYLD是microRNA-1271的潛在靶基因；K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染microRNA-1271抑制物下調(diào)microRNA-1271后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示CYLD蛋白水平明顯上調(diào)。結(jié)論人白血病細(xì)胞中microRNA-1271的表達(dá)上調(diào)，下調(diào)microRNA-1271后可以促進(jìn)靶基因CYLD蛋白的表達(dá)，microRNA-1271有可能成為白血病治療的新靶點(diǎn)。

白血病；microRNA；microRNA-1271；CYLD

微小RNA（microRNA）是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的大小為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，microRNA作為調(diào)控基因表達(dá)的重要分子，可以通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻譯［1］。microRNA在調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖與凋亡等方面都起著非常重要的作用［2］。研究［3－4］表明microRNA在臨床常見類型的白血病發(fā)病過程中起重要調(diào)控作用。前期報(bào)道［5］一個(gè)新的microRNA（microRNA-3666），靶向調(diào)控白血病細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，可能在白血病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。microRNA-1271在白血病細(xì)胞中的調(diào)控作用及其直接調(diào)控的靶基因至今仍然缺乏報(bào)道。該研究擬初步檢測(cè)microRNA-1271在白血病細(xì)胞中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步觀察microRNA-1271對(duì)白血病細(xì)胞中CYLD基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、熱滅活的胎牛血清購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Amaxa核轉(zhuǎn)染試劑盒（kit V）購自德國Amaxa Biosystems公司；Hsa-microRNA-1271及內(nèi)參U6 （RNU6B）特異性引物、microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自德國Qiagen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、psi-CHECK-2雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒DNA均購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)K562（人慢性髓原白血病細(xì)胞系）、NK-92、Jurkat細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清培養(yǎng)，HEK293A（人胚腎細(xì)胞株）采用DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清培養(yǎng)，以上細(xì)胞系均購自上海細(xì)胞庫。原代白血病細(xì)胞的分離來自于白血病患者的外周血，人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離來自于健康人外周血。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞總RNA提取及熒光定量PCR 目的細(xì)胞總RNA的提取依據(jù)TRIzol試劑說明書操作，按照microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進(jìn)行細(xì)胞cDNA的合成，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)用2－ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.2 microRNA寡核苷酸序列的合成 Hsa-microRNA-1271的成熟體序列（mimic）、Hsa-micro RNA-1271成熟體的反向互補(bǔ)序列，即microRNA-1271抑制物（anti-microRNA-1271），以及相應(yīng)的microRNA陰性對(duì)照（anti-microRNA-NC）均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.3.3 載體構(gòu)建 CYLD 3’UTR報(bào)告基因載體psi-CHECK-2-CYLD WT-3’UTR攜帶野生型（wild type，WT）的CYLD 3’UTR，而psi-CHECK-2-CYLD突變型（mutant）3’UTR則攜帶突變了microRNA-1271識(shí)別元件的3’UTR。兩個(gè)載體的構(gòu)建均以雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psi-CHECK-2為基礎(chǔ)，將野生型或突變型的CYLD 3’UTR序列插入psi-CHECK-2的多克隆位點(diǎn)，并通過測(cè)序鑒定載體構(gòu)建的正確性。

1.3.4 報(bào)告基因活性檢測(cè) HEK293A細(xì)胞鋪板，24 h后用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。microRNA-1271 mimic或microRNA陰性對(duì)照（microRNA-NC）的濃度為20 nmol／L，重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒0.2 μg，共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，48 h后按實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。

1.3.5 核轉(zhuǎn)染 根據(jù)Kit V核轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，采用第二代核轉(zhuǎn)染儀，程序設(shè)致為T-16，分別將anti-microRNA-1271及anti-microRNA-NC分別轉(zhuǎn)入K562白血病細(xì)胞系，20 h后收集細(xì)胞，并進(jìn)行后續(xù)所需的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)K562 細(xì)胞去除培養(yǎng)基，加入適量的蛋白裂解液，提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉1 h，加入CYLD一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育l h，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間差異采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白血病細(xì)胞中microRNA-1271的表達(dá)qRTPCR結(jié)果顯示，在人白血病細(xì)胞系以及急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）、慢性髓細(xì)胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）等3種原代白血病細(xì)胞中，microRNA-1271的表達(dá)均明顯高于正常人PBMC。見圖1。

2.2 Targetscan在線分析軟件預(yù)測(cè)microRNA-1271的潛在靶基因通過Targetscan在線分析軟件（www.targetscan.org），將microRNA名稱Hsa-microRNA-1271輸入檢索框中，點(diǎn)擊submit，系統(tǒng)預(yù)測(cè)出microRNA-1271的可能的靶基因。顯示在CYLD 的3′UTR上含有一段與microRNA-1271的結(jié)合位點(diǎn)（種子序列）。見圖2。

2.3 microRNA-1271對(duì)CYLD基因3′UTR的調(diào)控將microRNA-1271的mimic和攜帶CYLD 3’UTR的報(bào)告基因載體（3’WT UTR或3’mutant UTR）共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染3’WT UTR野生型載體的細(xì)胞熒光素酶活性顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染3’mutant UTR突變型載體的細(xì)胞熒光素酶活性未見變化。提示microRNA-1271能特異性作用于CYLD的3’UTR區(qū)域。見圖3。

2.4 microRNA-1271抑制物轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后CYLD表達(dá)變化研究顯示轉(zhuǎn)染anti-micro RNA-1271組，下調(diào)microRNA-1271的表達(dá)后，K562細(xì)胞中CYLD蛋白水平明顯上調(diào)（圖4）。

3 討論

microRNA在包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用［6－9］。因此，microRNA的功能研究對(duì)惡性腫瘤的臨床診斷和治療具有重要價(jià)值。而microRNA主要通過直接調(diào)控其下游特異性靶基因的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能［10－11］，因此，microRNA靶基因的尋找及鑒定是研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。

研究［12－13］報(bào)道m(xù)icroRNA-1271在某些實(shí)體瘤中具有重要的生物學(xué)功能，本研究為了探討microRNA-1271在白血病中的作用，首先檢測(cè)了microRNA-1271在多種白血病細(xì)胞系以及分離的原代白血病細(xì)胞中的表達(dá)情況，研究顯示microRNA-1271在白血病細(xì)胞中高表達(dá)。為了進(jìn)一步探討microRNA-1271在白血病細(xì)胞中的重要作用，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析microRNA-1271的靶基因，并首次證明CYLD是microRNA-1271的直接功能性靶基因。CYLD是2003年發(fā)現(xiàn)的具有去泛素化酶活性的抑癌基因。研究［14］顯示，在多種實(shí)體瘤中存在CYLD基因的突變或低表達(dá)。近來研究［15］表明，CYLD基因在白血病中存在不同程度的缺失或突變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在白血病細(xì)胞中，下調(diào)microRNA-1271后，CYLD蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。

綜上所述，microRNA-1271可通過靶向CYLD基因，調(diào)控其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而可能影響白血病細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，研究結(jié)果為進(jìn)一步完善白血病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為白血病的治療提供了可能的新靶點(diǎn)。

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microRNA-1271 regulates the expression of CYLD in leukemia cells

Zhang Qian，Wang Yuanyuan，Liu Liping，et al
（Dept of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo explore the regulatory effect of microRNA-1271 on the expression of its target gene CYLD in leukemia cells.MethodsmicroRNA-1271 expression levels in normal peripheral blood mononuclear cells（PBMC）and leukemia cells were determined by quantitative real-time PCR.microRNA-1271 targeting CYLD 3′-UTR was predicted by TargetScan.3′-UTR of CYLD was inserted into the dual luciferase reporter vector psi-CHECK2. The reporter activity was evaluated by the dual Luciferase Reporter Assay System after the luciferase promoter vector and microRNA were co-transferred into the HEK293A cell line.K562 cell lines were transfected with microRNA-1271 inhibitors（anti-microRNA-1271）or a negative control microRNA（anti-microRNA-NC），the expression of CYLD protein in the above transfected K562 cells were determined by Western blot.ResultsmicroRNA-1271 was up-regulated in human leukemia cell lines and primary leukemia cells compared to normal human PBMCs.The results of dual luciferase assays validate CYLD as a specific target gene of microRNA-1271.Inhibition of microRNA-1271 resulted in the upregulation of CYLD protein expression in K562 cell line.ConclusionmicroRNA-1271 is overexpressed in leukemia cells，the microRNA-1271 abnormal overexpression may play a key role in leukemia due to the down-regulation of CYLD.

leukemia；microRNA；microRNA-1271；CYLD

R 363

A

1000－1492（2015）07－0908－04

2015－03－13接收

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（編號(hào)：31300715）；安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（編號(hào)：1308085QH136）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

張 茜，女，主管藥師；倪 芳，女，副教授，責(zé)任作者，E-mail：nifang1203＠126. com