岳嗣鳳，張華

rhEPO對新型BPD模型肺組織BCL-2和Caspase-9表達(dá)的影響及意義

岳嗣鳳，張華

目的探討磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）通路在重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）保護(hù)新型支氣管肺發(fā)育不良（BPD）中的作用。方法40只定期受孕的SD大鼠，于孕第15天孕囊內(nèi)注射脂多糖（LPS）或磷酸鹽緩沖液（PBS），新生大鼠分為4組：對照組、高氧組、rhEPO組、rhEPO＋LY294002組。采用Western blot法和RT-PCR法檢測肺組織中BCL-2和Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果

支氣管肺發(fā)育不良；重組人促紅細(xì)胞生成素；細(xì)胞凋亡；磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒重要的并發(fā)癥，致死率和致殘率極高。近年來，隨著肺泡表面活性物質(zhì)和機(jī)械通氣的應(yīng)用，極低出生體重兒和極早早產(chǎn)兒（胎齡＜28周）成活率不斷上升，BPD的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，目前仍無確切有效的防治方法。研究［1］顯示，重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）能治療并降低早產(chǎn)兒BPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，于生后4周內(nèi)使用療效明顯，但其機(jī)制尚未明確。磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡、膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。研究［2－3］證實(shí)，PI3K／AKT通路可通過B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、半胱天冬酶（Caspase-9）和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF-κB）等途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。該研究應(yīng)用rhEPO及LY294002干預(yù)新型BPD大鼠模型，觀察肺組織Caspase-9和BCL-2的表達(dá)，探討外源性rhEPO對新型BPD大鼠模型的保護(hù)機(jī)制，為rhEPO的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料清潔級SD大鼠，雌鼠40只，體重230～250 g；雄鼠20只，體重280～300 g，均由廣西醫(yī)科大學(xué)－廣西實(shí)驗(yàn)動物中心提供。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自美國Sigma公司；LY294002購自美國Selleck公司；rhEPO購自協(xié)和發(fā)酵麒麟（中國）制藥有限公司；WIP裂解液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCL-2、Caspase-9及β-actin一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自北京康為世紀(jì)公司；β-actin、BCL-2引物由Invitrogen（上海）公司合成；Caspase-9引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。引物序列：BCL-2（188 bp）上游引物：5′-GCCTTCTTTGAGTTCGGT-3′，下游引物：5′-TCAAACAGAGGTCGCAT-3′；Caspase-9（204 bp）上游引物：5′-TGGCATACACCCTGGACTC-3′，下游引物：5′-TCTCCATCAAAGCCGTGAC-3′；β-actin（299 bp）上游引物：5′-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3′，下游引物：5′-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型的制備及分組 40只懷孕第15天（70%胎齡）的SD大鼠隨機(jī)分成兩組：LPS組（30只）和PBS組（10只）。參閱前期本課題組的實(shí)驗(yàn)方法［4］。孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（5 ml／kg）麻醉，切開腹腔，將LPS（30 ng／ml）按5 μl每孕囊注射到孕囊內(nèi)，PBS組注入等量的PBS。所產(chǎn)新生大鼠生后12 h內(nèi)分為4組：對照組、高氧組、rhEPO組、rhEPO＋LY294002組，每組24只。高氧組新生大鼠連同母鼠一起飼養(yǎng)于氧箱內(nèi)，持續(xù)給氧，維持氧濃度60%，氧箱內(nèi)放置無水氯化鈣吸收水分，鈉石灰吸收過多的CO2；rhEPO治療組在高氧干預(yù)第1、3、5、7、9、11、13天背部皮下注射rhEPO（1 200 IU／kg），LY294002處理組于每次注射rhEPO前30 min背部皮下注射LY294002（0.3 mg／kg），共7次。對照組新生大鼠連同母鼠置常壓空氣中飼養(yǎng)。

1.2.2 肺組織標(biāo)本采集 于實(shí)驗(yàn)第1、7、14天每組隨機(jī)選取8只，10%水合氯醛（3 ml／kg）腹腔麻醉后，斷頭放血處死動物，迅速打開胸腔，取雙肺，液氮速凍后存于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blot法檢測肺組織BCL-2、Caspase-9蛋白表達(dá) 在液氮冷凍下研磨肺組織，將組織粉末轉(zhuǎn)移到EP管中，加入1 ml WIP裂解液，冰上放置15 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液并適量分裝，測定總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，按各孔加入30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，然后加入BCL-2、Caspase-9或β-actin一抗（1∶300稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶6 000稀釋），室溫孵育50 min，洗膜后進(jìn)行ECL顯影，X光片曝光，拍照測定條帶灰度值，計(jì)算BCL-2和Caspase-9與β-actin灰度值的比值，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 肺組織BCL-2、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法，將肺組織研磨成粉末，根據(jù)超純總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，取2 μl RNA溶液置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測其完整性，紫外分光光度計(jì)測RNA濃度和純度，計(jì)算上樣體積，取總RNA 3 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物于含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果通過自動凝膠圖像分析儀顯示并拍照，分別測定條帶光密度值，計(jì)算BCL-2、Caspase-9與β-actin光密度值的比值，重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)第1、7、14天：與對照組比較，高氧組BCL-2蛋白表達(dá)顯著減弱，Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高氧組比較，rhEPO 組BCL-2蛋白表達(dá)增加，Caspase-9蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與rhEPO組比較，rhEPO＋LY294002組BCL-2蛋白表達(dá)明顯下降，Caspase-9蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；高氧組和rhEPO＋LY294002組BCL-2蛋白表達(dá)均明顯降低，Caspase-9蛋白表達(dá)均明顯增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達(dá)（n＝8，±s）

表1 不同實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達(dá)（n＝8，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與高氧組比較：＃P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05

項(xiàng)目對照組高氧組rhEPO組rhEPO＋LY294002組F值P值BCL-2 第1天0.56±0.140.35±0.10*0.46±0.09＃0.35±0.07△7.4520.002 第7天0.59±0.150.37±0.11*0.56±0.13＃0.37±0.10△7.1450.001 第14天0.75±0.220.41±0.16*0.64±0.20＃0.41±0.15△6.6100.002 Caspase-9 第1天0.33±0.070.52±0.11*0.40±0.11＃0.50±0.09△6.5910.002 第7天0.37±0.080.63±0.11*0.39±0.09＃0.62±0.12△15.6990.000 第14天0.44±0.080.81±0.11*0.49±0.09＃0.79±0.14△26.4330.000

2.2 肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)第1、7、14天：與對照組比較，高氧組BCL-2 mRNA表達(dá)明顯減少，Caspase-9 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與高氧組比較，rhEPO組BCL-2 mRNA表達(dá)增加，Caspase-9 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與rhEPO組比較，rhEPO＋LY294002組BCL-2 mRNA表達(dá)明顯降低，Caspase-9 mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高氧組和rhEPO＋LY294002組，BCL-2 mRNA表達(dá)均明顯降低，Caspase-9 mRNA表達(dá)均顯著增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2，圖2、3。

3 討論

目前認(rèn)為早產(chǎn)、宮內(nèi)感染性肺炎、長時(shí)間吸氧及機(jī)械通氣等是BPD的主要危險(xiǎn)因素［5］。研究［6］顯示，80%早于30周分娩的產(chǎn)婦存在不同程度的宮內(nèi)感染，胎肺長期暴露于炎性環(huán)境中。早產(chǎn)兒，尤其是小早產(chǎn)兒肺功能不完善，需要長時(shí)間吸氧和機(jī)械通氣，常并發(fā)氣壓傷及反復(fù)肺部感染，加重肺血管及肺間質(zhì)損傷。新生SD大鼠與新生兒肺發(fā)育過程具有很強(qiáng)的相似性，新生大鼠的肺發(fā)育處于囊泡期，肺泡期發(fā)生于生后4～13 d，新生大鼠相當(dāng)于胎齡＜30周早產(chǎn)兒的肺發(fā)育階段［7］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M宮內(nèi)感染及生后高氧暴露建立新型BPD模型，并在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，具有科學(xué)性和可行性。

宮內(nèi)炎性暴露及生后高氧損傷是導(dǎo)致新型BPD發(fā)生的重要因素。研究［8］表明，孕期注射LPS可導(dǎo)致胚胎期及出生早期肺組織細(xì)胞過度凋亡，肺組織上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，肺微血管發(fā)育受阻，其機(jī)制可能與Bax／Bcl-2途徑有關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)［9］顯示，高氧干預(yù)可導(dǎo)致新生小鼠肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，隨著高氧時(shí)間延長肺凋亡數(shù)增加越明顯，凋亡數(shù)與肺損傷程度相關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS（30 ng／ml）孕囊注射聯(lián)合生后高氧可增加肺Caspase-9表達(dá)、減少BCL-2表達(dá)，推測宮內(nèi)感染聯(lián)合生后高氧暴露可導(dǎo)致新生大鼠肺細(xì)胞凋亡增加。

rhEPO是一種多功能的糖蛋白類激素，具有抗氧化、抗炎、抑制凋亡及促進(jìn)血管生成等非造血作用［10］，對高氧和感染所致的肺損傷具有保護(hù)作用。研究［11］顯示，rhEPO可減少高氧肺損傷模型的細(xì)胞凋亡指數(shù)，從而減輕高氧性肺損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rhEPO干預(yù)能有效減少SD新生大鼠新型BPD模型肺Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)，同時(shí)增加BCL-2蛋白及mRNA表達(dá)，從而推測rhEPO可能通過抑制細(xì)胞凋亡，對新型BPD發(fā)揮保護(hù)作用。

表2 不同實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達(dá)（n＝8，±s）

表2 不同實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達(dá)（n＝8，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與高氧組比較：＃P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05

項(xiàng)目對照組高氧組rhEPO組rhEPO＋LY294002組F值P值BCL-2 第1天0.32±0.040.09±0.04*0.18±0.03＃0.12±0.02△63.9610.000 第7天0.45±0.090.17±0.12*0.36±0.10＃0.20±0.08△14.8760.000 第14天0.51±0.090.10±0.08*0.44±0.12＃0.14±0.03△49.1810.000 Caspase-9 第1天0.21±0.140.59±0.09*0.41±0.14＃0.62±0.07△21.5820.000 第7天0.27±0.120.74±0.09*0.37±0.13＃0.76±0.05△50.4220.000 第14天0.25±0.150.91±0.07*0.30±0.10＃0.86±0.11△81.3220.000

PI3K是聯(lián)系胞外信號與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答效應(yīng)的橋梁，可通過多種途徑作用于其下游信號因子，對細(xì)胞凋亡起調(diào)節(jié)作用［12－13］，其中Caspase-9是PI3K／AKT傳導(dǎo)通路下游細(xì)胞凋亡的啟動者和效應(yīng)者，BCL-2則具有抗凋亡的作用。LY294002是PI3K特異性抑制劑，通過抑制PI3K活性，使AKT活化受阻，抑制PI3K／AKT通路的功能。本課題前期研究［3］顯示：在新型BPD模型中，rhEPO明顯增加肺組織PI3K蛋白和mRNA的表達(dá)，有效減少肺細(xì)胞的凋亡，推測rhEPO的抗凋亡作用可能與上調(diào)PI3K／AKT通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過在新型BPD模型新生大鼠背部皮下注射LY294002（0.3 mg／kg），然后觀察Caspase-9和BCL-2表達(dá)變化，結(jié)果顯示Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，而BCL-2蛋白及mRNA表達(dá)減弱，推測rhEPO對新型BPD的保護(hù)機(jī)制可能與PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

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The effect and significance of rhEPO to the expression of BCL-2 and Caspase-9 in the new type BPD model’s lung tissue

Yue Sifeng，Zhang Hua
（Dept of Newborn，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001）

ObjectiveTo explore the role of phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase B（PI3K／AKT）pathway in recombinant human erythropoietin（rhEPO）protecting new type BPD.MethodsInjected LPS or PBS to 40 sprague-dawley（SD）rats，gestational sacs on 15th day of gestation，the newborn rats were divided into four groups：control group，hyperoxia group，rhEPO group，rhEPO＋LY294002 group.To detect the expression of lung tissue BCL-2 and Caspase-9 protein and mRNA by Western blot and RT-PCR.ResultsIn the hyperoxia group and rhEPO＋LY294002 group，BCL-2 expression was decreased，while Caspase-9 expression was increased apparently；in the rhEPO group，BCL-2 expression was increased，while Caspase-9 expression was decreased.The differences between each group were statistically significant on 1st，7th and 14th day of hyperoxia exposure（P＜0.05）.ConclusionIntrauterine inflammatory exposure combined with hyperoxia after birth can cause lung cell apoptosis increases.While rhEPO has certain control effects on BPD，possibly by reducing the pulmonary apoptosis.The mechanism may be associated with PI3K／AKT signaling pathway.

bronchopulmonary dysplasia；recombinant human erythropoietin；apoptosis；phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase B

R 332

A

1000－1492（2015）07－0933－04

2015－03－10接收

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題（編號：重2011011）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，桂林 541001

岳嗣鳳，女，碩士研究生；張 華，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zh4205＠163.com

高氧組、rhEPO＋LY294002組新生大鼠肺組織BCL-2蛋白及mRNA表達(dá)減少，Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)明顯增加；rhEPO組BCL-2蛋白及mRNA表達(dá)增加，Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)減少；于高氧暴露第1、7、14天各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論宮內(nèi)炎性暴露聯(lián)合生后高氧可導(dǎo)致肺細(xì)胞凋亡增加，rhEPO可能通過減少肺細(xì)胞凋亡，對新型BPD起一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與PI3K／AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。