利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?/h1>
2015-06-01 09:43:53黃家惠張大剛徐德祥
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2015年7期
黃家惠，陳 熙，張 程，陶 莉，何 薇，齊 軍，張大剛，徐德祥
利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?/p>
黃家惠1，陳 熙1，張 程2，陶 莉1，何 薇1，齊 軍1，張大剛1，徐德祥2
目的觀察利福平（RIF）引起的小鼠肝臟脂肪變及其動(dòng)態(tài)演變過程，為進(jìn)一步探討藥物性脂肪肝的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法將42只成年健康雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組（對(duì)照組，RIF 8 h、24 h、3 d、1周、2周、4周組），經(jīng)灌胃給予RIF處理（200 mg／kg），末次給藥后禁食6 h處死小鼠，采集血液及肝臟組織。計(jì)算肝臟系數(shù)；檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性；HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)改變；檢測血清中三酰甘油（TG）、膽固醇酯（TCH）、高密度脂蛋白（HDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）水平；檢測肝臟組織中TG水平；油紅O染色檢測肝臟組織脂質(zhì)沉積。結(jié)果與對(duì)照組比較，RIF處理組小鼠肝臟重量、系數(shù)均從24 h開始逐漸升高，4周時(shí)達(dá)到高峰；與對(duì)照組比較，24 h、3 d、1周、2周組ALT水平逐漸升高，4周組ALT水平顯著升高。HE染色顯示8、24 h組肝臟組織無明顯變化，3 d組可見小的空泡，而從1周開始出現(xiàn)顯著增多的大的圓形空泡。8、24 h組血清中TG和VLDL水平較對(duì)照組輕度升高，3 d時(shí)升高最明顯，而1、2、4周組中呈下降趨勢，且顯著低于對(duì)照組。RIF處理各組血清TCH、HDL水平均較對(duì)照組降低。肝臟組織TG含量從8 h開始明顯升高，1周時(shí)達(dá)峰值，之后2、4周組呈下降趨勢但仍顯著高于對(duì)照組。油紅O染色結(jié)果顯示，8、24 h組肝臟組織中可見少量脂質(zhì)沉積，從3 d組開始出現(xiàn)顯著增多的大圓形脂滴。結(jié)論RIF能引起小鼠肝臟組織中脂質(zhì)沉積，且呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
小鼠；利福平；脂肪肝；脂質(zhì)沉積
導(dǎo)致藥物性肝損傷的藥物（包括中草藥）有1 100余種，隨著臨床藥物的不斷增多，藥物性肝損傷的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢［1］。藥物性肝損傷主要有肝細(xì)胞死亡、脂肪變性、膽汁淤積、肝竇狀隙損害、肝纖維化與肝硬化、肝癌變等類型，其中藥物性脂肪肝約占藥物性肝損傷的2%，并有不斷增加的趨勢［2－3］。研究［4］表明，抗結(jié)核藥物是導(dǎo)致急性藥物性肝損傷的主要原因。前期研究［5－7］表明，單次或連續(xù)給予利福平（rifampicin，RIF）均可誘發(fā)小鼠肝內(nèi)膽汁淤積，RIF所致的膽汁淤積與肝細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和occludin完整性破壞有關(guān)；連續(xù)給予小鼠RIF 1周可引起小鼠肝臟組織三酰甘油（triglyceride，TG）含量明顯升高，油紅O染色也顯示小鼠肝臟組織中可見大量脂質(zhì)沉積。但RIF對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響鮮有報(bào)道，該研究旨在建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上觀察RIF引起的小鼠肝臟脂肪變及其動(dòng)態(tài)變化過程，為進(jìn)一步探討其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器RIF購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TG試劑盒購自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源和處理清潔級(jí)健康ICR成年雄鼠，4～5周齡，重20～23 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食、晝夜均衡，溫度20～25℃，濕度（50±5）%，隨機(jī)分為7組：對(duì)照組，RIF 8 h組、24 h組、3 d組、1周組、2周組、4周組，每組6只，見圖1。早上9點(diǎn)小鼠空腹灌胃給予RIF（200 mg／kg）處理，在取材前8 h和24 h給予8 h組和24 h組灌胃1次，3 d組、1周組、2周組、4周組給藥頻率為1次／d，末次給藥后禁食6 h處死小鼠，采集血液及肝臟組織，肝組織稱重，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肝組織2塊，1塊立即用于制備冰凍切片，1塊置于4%多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片；其余肝組織切成小塊，置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存待用。RIF不同時(shí)間點(diǎn)處理示意圖見圖1。
1.3 肝臟系數(shù)計(jì)算稱取小鼠體重及肝臟重量，計(jì)算肝臟系數(shù)（%）＝（肝臟重量／體重）×100%。
1.4 ALT水平測定通過賴氏比色法測定ALT水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。
1.5 HE染色法觀察肝組織病理學(xué)變化取受試動(dòng)物部分肝組織置于4%多聚甲醛溶液中固定12～24 h后，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色、中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變并攝片。
1.6 血清肝生化指標(biāo)檢測TG、總膽固醇（total cholesterol，TCH）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的測定采用酶比色法，采用安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司RL7600D全自動(dòng)生化分析儀）檢測。
1.7 肝組織TG含量測定參照Zhou et al［8］的方法，萃取肝臟組織脂質(zhì)后，肝組織TG含量的測定按照TG試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
1.8 油紅O染色觀察肝組織脂質(zhì)沉積處死小鼠后取新鮮肝組織，在最適切割溫度下包埋后－20℃制備冰凍切片，切片厚度為10 μm。將冰凍切片置于4%多聚甲醛溶液中固定30 min后，用3%油紅O染液室溫染色30 min，蘇木精復(fù)染30 s，甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積并攝片。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)均采用±s表示。多組均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 RIF處理對(duì)小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響與對(duì)照組比較，RIF處理24 h、3 d、1周、2周、4周組小鼠肝臟系數(shù)較對(duì)照組均顯著升高（F＝39.273，P ＜0.05）。見表1。
2.2 RIF處理對(duì)小鼠血清ALT水平的影響與對(duì)照組比較，8 h組、24 h組小鼠血清ALT水平無明顯變化，3 d組、1周組、2周組ALT水平較對(duì)照組分別升高約2倍～3倍，4周組ALT水平升高最明顯，約為對(duì)照組10倍（P＜0.01）。見圖2。
2.3 肝臟組織病理學(xué)改變正常肝臟組織肉眼觀察呈紅褐色，邊緣銳利，表面光滑；RIF處理各組肝臟組織肉眼觀察呈橘紅色，體積增大，邊緣鈍而厚，切面呈油膩感。HE染色顯示，正常肝臟組織可見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。RIF處理8 h組、24 h組肝細(xì)胞質(zhì)中可見少量大小不等圓形空泡，部分細(xì)胞核偏向一側(cè)，3 d組、1周組、2周組、4周組可見肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顯著增多、大小不等的圓形空泡，大者充滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，將細(xì)胞核擠至一側(cè)。見圖3。
表1 RIF處理對(duì)小鼠生理的影響（n＝6，±s）
表1 RIF處理對(duì)小鼠生理的影響（n＝6，±s）
與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01
指標(biāo)對(duì)照組RIF 8 h組24 h組3 d組1周組2周組4周組體重（g）40.8±5.343.1±3.141.2±1.740.1±4.740.5±4.539.5±2.140.6±2.3肝臟重量（g）2.21±0.272.27±0.232.59±0.24*2.49±0.373.09±0.56**3.46±0.36**4.04±0.46**肝臟系數(shù)（%）0.054±0.000.053±0.000.063±0.00**0.062±0.00**0.076±0.01**0.087±0.01**0.100±0.01**
2.4 RIF處理對(duì)小鼠血清TG、TCH、VLDL、HDL的影響與對(duì)照組比較，RIF處理8 h、24 h組小鼠血清TG、VLDL無明顯變化，3 d組小鼠血清TG、VLDL顯著升高（P＜0.05），達(dá)到峰值，之后1周、2周、4周組小鼠血清TG、VLDL水平均顯著低于對(duì)照組（F＝12.809，P＜0.01），且隨RIF處理時(shí)間的延長而逐漸降低；小鼠血清TCH、HDL水平在RIF處理8 h后開始降低（P＜0.01），但在24 h、3 d組下降不明顯，在1周之后，TCH水平開始明顯降低（P ＜0.01），HDL水平下降明顯（P＜0.05）。見表2。
2.5 RIF處理對(duì)小鼠肝臟組織TG含量的影響與對(duì)照組比較，RIF處理各組肝臟組織TG相對(duì)含量和TG總量從8 h后開始明顯升高，1周時(shí)達(dá)到峰值，之后2周、4周組肝臟組織TG相對(duì)含量呈降低趨勢（F＝155.938），均顯著低于1周組（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01），呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，而2周、4周組肝臟組織TG總量則較1周組無明顯變化。見表3。
2.6 肝臟組織油紅O染色改變油紅O染色顯示，正常肝臟組織幾乎無紅染，RIF處理8 h、24 h組可見少量小圓形紅染脂滴；3 d組可見紅染脂滴明顯增多且較大，充滿視野；1周、2周、4周組則可見充滿視野的大泡狀圓形紅染脂滴。見圖4。
3 討論
表2 RIF處理對(duì)小鼠血清中生化指標(biāo)的影響（n＝6，xˉ±s）
表3 RIF處理對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)的影響（n＝6，±s）
表3 RIF處理對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)的影響（n＝6，±s）
與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與1周組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01
指標(biāo)對(duì)照組RIF 8 h組24 h組3 d組1周組2周組4周組TG相對(duì)含量（μmol／g）8.00±1.0911.09±1.98*10.63±1.99*24.27±2.36**36.25±3.08**30.17±1.36**＃＃26.79±1.97**＃＃TG總量（μmol）17.57±2.1625.31±6.38*27.35±4.67*60.43±10.94**111.99±22.43**104.26±10.49**108.38±17.02**
為探索RIF最佳給藥劑量，本課題組前期實(shí)驗(yàn)［5－6］分別連續(xù)經(jīng)口灌胃給予不同劑量RIF，顯示給予200 mg／kg的劑量時(shí)小鼠肝臟損傷最為嚴(yán)重，因此該研究選取200 mg／kg的給藥劑量，選取RIF給藥的6個(gè)時(shí)點(diǎn)（8 h、24 h、3 d、1周、2周、4周）進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。本研究結(jié)果顯示，RIF處理的各組小鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)均升高，且隨給藥時(shí)間的延長而逐漸升高。RIF處理各組小鼠ALT水平隨處理時(shí)間的延長而逐漸升高，在4周時(shí)ALT水平升高最為明顯。
藥物及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解的任一個(gè)過程產(chǎn)生影響都有可能導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂質(zhì)的異常聚積，進(jìn)而發(fā)生脂肪變性形成脂肪肝［9］。前期研究［10］證明，RIF單次及連續(xù)1周處理，小鼠肝臟中脂肪酸合成的關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶水平均顯著上調(diào)，提示脂肪酸的合成在RIF引起小鼠肝臟脂肪變的過程中發(fā)揮重要作用。VLDL是運(yùn)輸內(nèi)源性TG的主要形式，肝細(xì)胞分泌的VLDL升高是高脂血癥的重要原因，且與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［11］。本研究顯示，RIF處理8 h、24 h、3 d組血清TG水平逐漸升高，3 d時(shí)達(dá)到峰值，血清VLDL水平變化趨勢與之相同，肝組織TG相對(duì)含量及總量也逐漸升高，提示RIF處理8 h、24 h、3 d組可能是由于血清中VLDL介導(dǎo)的由肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)至外周的TG增多導(dǎo)致血清中TG升高，肝臟TG相對(duì)含量及總量的升高可能是肝臟TG的合成增多和／或TG的分解減少起主導(dǎo)作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
肝臟VLDL的組裝有兩步過程［12］，第1步：TG移位到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，與載脂蛋白B合成VLDL前體；第2步：大的中性脂肪，特別是TG，在高爾基體內(nèi)被加至VLDL前體形成富含TG的VLDL，成熟的VLDL再分泌至外周，成為運(yùn)輸內(nèi)源性TG的主要形式［13－15］。RIF處理小鼠血清TG水平在3 d時(shí)達(dá)到峰值，1周、2周、4周組均顯著低于對(duì)照組，且隨RIF處理時(shí)間的延長而逐漸降低，血清VLDL水平的變化與TG水平變化趨勢相同。而RIF處理肝組織TG相對(duì)含量1周時(shí)達(dá)到高峰，之后2周、4周組肝組織TG相對(duì)含量較1周組顯著下降，但仍顯著高于對(duì)照組，呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步觀察顯示，雖然肝組織TG相對(duì)含量降低，但由于肝臟重量明顯增加，其所含TG總量與1周組相當(dāng)，未出現(xiàn)明顯降低，結(jié)合血清中VLDL的變化趨勢，提示RIF處理1周、2周、4周組可能是由于VLDL的組裝或分泌障礙，導(dǎo)致VLDL合成或分泌減少，進(jìn)而引起肝臟合成的TG無法轉(zhuǎn)運(yùn)至外周，過量的TG在肝臟內(nèi)沉積，導(dǎo)致血中TG含量下降，而肝組織中TG含量升高。
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Mouse model of fatty liver induced by rifampicin
Huang Jiahui1，Chen Xi1，Zhang Cheng2，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，The Key Laboratory of Gastroenterology of Anhui Province，Hefei 230022；2Dept of Toxicology，Anhui Medical University，Hefei 230032）
ObjectiveTo observe the time-course of rifampicin（RIF）-induced fatty liver in mice in order to lay the foundation for investigating the mechanism of the drug-induced fatty liver.MethodsForty-two healthy male mice were randomly divided into seven groups（control，8 h，24 h，3 d，1 week，2 weeks，4 weeks），and mice were administered with RIF 200 mg／kg daily by gavage.All mice were sacrificed at 6 h after the last administration to collect serum and liver tissues.All their body weight and liver weight was measured for calculating liver to body weight ratio.The levels of alanine aminotranferase（ALT）in serum was measured.Hepatic pathological changes were observed by HE staining.The levels of triglyceride（TG），cholesterol ester（TCH），very low density lipoprotein （VLDL），high-density lipoprotein（HDL）in serum were measured.Liver tissue was dissected for measuring TG. The lipid accumulation of liver was observed by oil red O staining.ResultsCompared with control group，liver weight and liver to body weight ratio began to rise gradually 24 h after RIF-treated mice.Compared with mice in control group，the serum levels of ALT slightly increased in 8 h，24 h，3 d，1 week and 2 weeks groups，and significantly increased in 4 weeks group.HE staining showed 8 h and 24 h after RIF treatment，liver tissue did not see clear change.3 d group was smaller vacuoles，part of the nucleus to one side，and starting from 1 week liver tissue that was dramatically increasing number of large circular cavity.The levels of TG，VLDL in the serum were moderately elevated in 8 h，24 h groups，the most obvious was elevated in 3 d group，and begin to decline from 1 week. Serum levels of TCH，HDL in RIF-treated groups were relatively lower than control group.The liver TG levels significantly increased from 8 h，and peaked in 1 week group，then presented downward trend in 2 weeks and 4 weeks groups but higher than control group.The results of oil red O staining showed that 8 h and 24 h after RIF treatment，there was a small amount of lipid deposition in the liver，and large circular lipid drops in liver tissue dramatically increased after 3 d.ConclusionAdministration of rifampicin causes hepatic steatosis in mice and shows the obvious time-effect relationship.
mice；rifampicin；fatty liver；hepatic steatosis
R 575.5；R 978.3
A
1000－1492（2015）07－0937－05
2015－04－14接收
國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81001480）；2013年高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)（編號(hào)：20133420110005）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH120）；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A159）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目（編號(hào)：2011SQRL058ZD）
1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230022
2安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)系，合肥 230032
黃家惠，女，碩士研究生；陳 熙，女，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayfychenxi＠gmail.com
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利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?/p>
黃家惠1，陳 熙1，張 程2，陶 莉1，何 薇1，齊 軍1，張大剛1，徐德祥2
目的觀察利福平（RIF）引起的小鼠肝臟脂肪變及其動(dòng)態(tài)演變過程，為進(jìn)一步探討藥物性脂肪肝的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法將42只成年健康雄性ICR小鼠隨機(jī)分為7組（對(duì)照組，RIF 8 h、24 h、3 d、1周、2周、4周組），經(jīng)灌胃給予RIF處理（200 mg／kg），末次給藥后禁食6 h處死小鼠，采集血液及肝臟組織。計(jì)算肝臟系數(shù)；檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性；HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)改變；檢測血清中三酰甘油（TG）、膽固醇酯（TCH）、高密度脂蛋白（HDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）水平；檢測肝臟組織中TG水平；油紅O染色檢測肝臟組織脂質(zhì)沉積。結(jié)果與對(duì)照組比較，RIF處理組小鼠肝臟重量、系數(shù)均從24 h開始逐漸升高，4周時(shí)達(dá)到高峰；與對(duì)照組比較，24 h、3 d、1周、2周組ALT水平逐漸升高，4周組ALT水平顯著升高。HE染色顯示8、24 h組肝臟組織無明顯變化，3 d組可見小的空泡，而從1周開始出現(xiàn)顯著增多的大的圓形空泡。8、24 h組血清中TG和VLDL水平較對(duì)照組輕度升高，3 d時(shí)升高最明顯，而1、2、4周組中呈下降趨勢，且顯著低于對(duì)照組。RIF處理各組血清TCH、HDL水平均較對(duì)照組降低。肝臟組織TG含量從8 h開始明顯升高，1周時(shí)達(dá)峰值，之后2、4周組呈下降趨勢但仍顯著高于對(duì)照組。油紅O染色結(jié)果顯示，8、24 h組肝臟組織中可見少量脂質(zhì)沉積，從3 d組開始出現(xiàn)顯著增多的大圓形脂滴。結(jié)論RIF能引起小鼠肝臟組織中脂質(zhì)沉積，且呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。
小鼠；利福平；脂肪肝；脂質(zhì)沉積
導(dǎo)致藥物性肝損傷的藥物（包括中草藥）有1 100余種，隨著臨床藥物的不斷增多，藥物性肝損傷的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢［1］。藥物性肝損傷主要有肝細(xì)胞死亡、脂肪變性、膽汁淤積、肝竇狀隙損害、肝纖維化與肝硬化、肝癌變等類型，其中藥物性脂肪肝約占藥物性肝損傷的2%，并有不斷增加的趨勢［2－3］。研究［4］表明，抗結(jié)核藥物是導(dǎo)致急性藥物性肝損傷的主要原因。前期研究［5－7］表明，單次或連續(xù)給予利福平（rifampicin，RIF）均可誘發(fā)小鼠肝內(nèi)膽汁淤積，RIF所致的膽汁淤積與肝細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和occludin完整性破壞有關(guān)；連續(xù)給予小鼠RIF 1周可引起小鼠肝臟組織三酰甘油（triglyceride，TG）含量明顯升高，油紅O染色也顯示小鼠肝臟組織中可見大量脂質(zhì)沉積。但RIF對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響鮮有報(bào)道，該研究旨在建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上觀察RIF引起的小鼠肝臟脂肪變及其動(dòng)態(tài)變化過程，為進(jìn)一步探討其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器RIF購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TG試劑盒購自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源和處理清潔級(jí)健康ICR成年雄鼠，4～5周齡，重20～23 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食、晝夜均衡，溫度20～25℃，濕度（50±5）%，隨機(jī)分為7組：對(duì)照組，RIF 8 h組、24 h組、3 d組、1周組、2周組、4周組，每組6只，見圖1。早上9點(diǎn)小鼠空腹灌胃給予RIF（200 mg／kg）處理，在取材前8 h和24 h給予8 h組和24 h組灌胃1次，3 d組、1周組、2周組、4周組給藥頻率為1次／d，末次給藥后禁食6 h處死小鼠，采集血液及肝臟組織，肝組織稱重，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肝組織2塊，1塊立即用于制備冰凍切片，1塊置于4%多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片；其余肝組織切成小塊，置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存待用。RIF不同時(shí)間點(diǎn)處理示意圖見圖1。
1.3 肝臟系數(shù)計(jì)算稱取小鼠體重及肝臟重量，計(jì)算肝臟系數(shù)（%）＝（肝臟重量／體重）×100%。
1.4 ALT水平測定通過賴氏比色法測定ALT水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。
1.5 HE染色法觀察肝組織病理學(xué)變化取受試動(dòng)物部分肝組織置于4%多聚甲醛溶液中固定12～24 h后，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色、中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變并攝片。
1.6 血清肝生化指標(biāo)檢測TG、總膽固醇（total cholesterol，TCH）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的測定采用酶比色法，采用安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司RL7600D全自動(dòng)生化分析儀）檢測。
1.7 肝組織TG含量測定參照Zhou et al［8］的方法，萃取肝臟組織脂質(zhì)后，肝組織TG含量的測定按照TG試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
1.8 油紅O染色觀察肝組織脂質(zhì)沉積處死小鼠后取新鮮肝組織，在最適切割溫度下包埋后－20℃制備冰凍切片，切片厚度為10 μm。將冰凍切片置于4%多聚甲醛溶液中固定30 min后，用3%油紅O染液室溫染色30 min，蘇木精復(fù)染30 s，甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積并攝片。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)均采用±s表示。多組均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 RIF處理對(duì)小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響與對(duì)照組比較，RIF處理24 h、3 d、1周、2周、4周組小鼠肝臟系數(shù)較對(duì)照組均顯著升高（F＝39.273，P ＜0.05）。見表1。
2.2 RIF處理對(duì)小鼠血清ALT水平的影響與對(duì)照組比較，8 h組、24 h組小鼠血清ALT水平無明顯變化，3 d組、1周組、2周組ALT水平較對(duì)照組分別升高約2倍～3倍，4周組ALT水平升高最明顯，約為對(duì)照組10倍（P＜0.01）。見圖2。
2.3 肝臟組織病理學(xué)改變正常肝臟組織肉眼觀察呈紅褐色，邊緣銳利，表面光滑；RIF處理各組肝臟組織肉眼觀察呈橘紅色，體積增大，邊緣鈍而厚，切面呈油膩感。HE染色顯示，正常肝臟組織可見肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。RIF處理8 h組、24 h組肝細(xì)胞質(zhì)中可見少量大小不等圓形空泡，部分細(xì)胞核偏向一側(cè)，3 d組、1周組、2周組、4周組可見肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顯著增多、大小不等的圓形空泡，大者充滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，將細(xì)胞核擠至一側(cè)。見圖3。
表1 RIF處理對(duì)小鼠生理的影響（n＝6，±s）
表1 RIF處理對(duì)小鼠生理的影響（n＝6，±s）
與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01
指標(biāo)對(duì)照組RIF 8 h組24 h組3 d組1周組2周組4周組體重（g）40.8±5.343.1±3.141.2±1.740.1±4.740.5±4.539.5±2.140.6±2.3肝臟重量（g）2.21±0.272.27±0.232.59±0.24*2.49±0.373.09±0.56**3.46±0.36**4.04±0.46**肝臟系數(shù)（%）0.054±0.000.053±0.000.063±0.00**0.062±0.00**0.076±0.01**0.087±0.01**0.100±0.01**
2.4 RIF處理對(duì)小鼠血清TG、TCH、VLDL、HDL的影響與對(duì)照組比較，RIF處理8 h、24 h組小鼠血清TG、VLDL無明顯變化，3 d組小鼠血清TG、VLDL顯著升高（P＜0.05），達(dá)到峰值，之后1周、2周、4周組小鼠血清TG、VLDL水平均顯著低于對(duì)照組（F＝12.809，P＜0.01），且隨RIF處理時(shí)間的延長而逐漸降低；小鼠血清TCH、HDL水平在RIF處理8 h后開始降低（P＜0.01），但在24 h、3 d組下降不明顯，在1周之后，TCH水平開始明顯降低（P ＜0.01），HDL水平下降明顯（P＜0.05）。見表2。
2.5 RIF處理對(duì)小鼠肝臟組織TG含量的影響與對(duì)照組比較，RIF處理各組肝臟組織TG相對(duì)含量和TG總量從8 h后開始明顯升高，1周時(shí)達(dá)到峰值，之后2周、4周組肝臟組織TG相對(duì)含量呈降低趨勢（F＝155.938），均顯著低于1周組（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01），呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，而2周、4周組肝臟組織TG總量則較1周組無明顯變化。見表3。
2.6 肝臟組織油紅O染色改變油紅O染色顯示，正常肝臟組織幾乎無紅染，RIF處理8 h、24 h組可見少量小圓形紅染脂滴；3 d組可見紅染脂滴明顯增多且較大，充滿視野；1周、2周、4周組則可見充滿視野的大泡狀圓形紅染脂滴。見圖4。
3 討論
表2 RIF處理對(duì)小鼠血清中生化指標(biāo)的影響（n＝6，xˉ±s）
表3 RIF處理對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)的影響（n＝6，±s）
表3 RIF處理對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)的影響（n＝6，±s）
與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與1周組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01
指標(biāo)對(duì)照組RIF 8 h組24 h組3 d組1周組2周組4周組TG相對(duì)含量（μmol／g）8.00±1.0911.09±1.98*10.63±1.99*24.27±2.36**36.25±3.08**30.17±1.36**＃＃26.79±1.97**＃＃TG總量（μmol）17.57±2.1625.31±6.38*27.35±4.67*60.43±10.94**111.99±22.43**104.26±10.49**108.38±17.02**
為探索RIF最佳給藥劑量，本課題組前期實(shí)驗(yàn)［5－6］分別連續(xù)經(jīng)口灌胃給予不同劑量RIF，顯示給予200 mg／kg的劑量時(shí)小鼠肝臟損傷最為嚴(yán)重，因此該研究選取200 mg／kg的給藥劑量，選取RIF給藥的6個(gè)時(shí)點(diǎn)（8 h、24 h、3 d、1周、2周、4周）進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。本研究結(jié)果顯示，RIF處理的各組小鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)均升高，且隨給藥時(shí)間的延長而逐漸升高。RIF處理各組小鼠ALT水平隨處理時(shí)間的延長而逐漸升高，在4周時(shí)ALT水平升高最為明顯。
藥物及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解的任一個(gè)過程產(chǎn)生影響都有可能導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂質(zhì)的異常聚積，進(jìn)而發(fā)生脂肪變性形成脂肪肝［9］。前期研究［10］證明，RIF單次及連續(xù)1周處理，小鼠肝臟中脂肪酸合成的關(guān)鍵酶脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶水平均顯著上調(diào)，提示脂肪酸的合成在RIF引起小鼠肝臟脂肪變的過程中發(fā)揮重要作用。VLDL是運(yùn)輸內(nèi)源性TG的主要形式，肝細(xì)胞分泌的VLDL升高是高脂血癥的重要原因，且與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［11］。本研究顯示，RIF處理8 h、24 h、3 d組血清TG水平逐漸升高，3 d時(shí)達(dá)到峰值，血清VLDL水平變化趨勢與之相同，肝組織TG相對(duì)含量及總量也逐漸升高，提示RIF處理8 h、24 h、3 d組可能是由于血清中VLDL介導(dǎo)的由肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)至外周的TG增多導(dǎo)致血清中TG升高，肝臟TG相對(duì)含量及總量的升高可能是肝臟TG的合成增多和／或TG的分解減少起主導(dǎo)作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
肝臟VLDL的組裝有兩步過程［12］，第1步：TG移位到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，與載脂蛋白B合成VLDL前體；第2步：大的中性脂肪，特別是TG，在高爾基體內(nèi)被加至VLDL前體形成富含TG的VLDL，成熟的VLDL再分泌至外周，成為運(yùn)輸內(nèi)源性TG的主要形式［13－15］。RIF處理小鼠血清TG水平在3 d時(shí)達(dá)到峰值，1周、2周、4周組均顯著低于對(duì)照組，且隨RIF處理時(shí)間的延長而逐漸降低，血清VLDL水平的變化與TG水平變化趨勢相同。而RIF處理肝組織TG相對(duì)含量1周時(shí)達(dá)到高峰，之后2周、4周組肝組織TG相對(duì)含量較1周組顯著下降，但仍顯著高于對(duì)照組，呈明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步觀察顯示，雖然肝組織TG相對(duì)含量降低，但由于肝臟重量明顯增加，其所含TG總量與1周組相當(dāng)，未出現(xiàn)明顯降低，結(jié)合血清中VLDL的變化趨勢，提示RIF處理1周、2周、4周組可能是由于VLDL的組裝或分泌障礙，導(dǎo)致VLDL合成或分泌減少，進(jìn)而引起肝臟合成的TG無法轉(zhuǎn)運(yùn)至外周，過量的TG在肝臟內(nèi)沉積，導(dǎo)致血中TG含量下降，而肝組織中TG含量升高。
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Mouse model of fatty liver induced by rifampicin
Huang Jiahui1，Chen Xi1，Zhang Cheng2，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，The Key Laboratory of Gastroenterology of Anhui Province，Hefei 230022；2Dept of Toxicology，Anhui Medical University，Hefei 230032）
ObjectiveTo observe the time-course of rifampicin（RIF）-induced fatty liver in mice in order to lay the foundation for investigating the mechanism of the drug-induced fatty liver.MethodsForty-two healthy male mice were randomly divided into seven groups（control，8 h，24 h，3 d，1 week，2 weeks，4 weeks），and mice were administered with RIF 200 mg／kg daily by gavage.All mice were sacrificed at 6 h after the last administration to collect serum and liver tissues.All their body weight and liver weight was measured for calculating liver to body weight ratio.The levels of alanine aminotranferase（ALT）in serum was measured.Hepatic pathological changes were observed by HE staining.The levels of triglyceride（TG），cholesterol ester（TCH），very low density lipoprotein （VLDL），high-density lipoprotein（HDL）in serum were measured.Liver tissue was dissected for measuring TG. The lipid accumulation of liver was observed by oil red O staining.ResultsCompared with control group，liver weight and liver to body weight ratio began to rise gradually 24 h after RIF-treated mice.Compared with mice in control group，the serum levels of ALT slightly increased in 8 h，24 h，3 d，1 week and 2 weeks groups，and significantly increased in 4 weeks group.HE staining showed 8 h and 24 h after RIF treatment，liver tissue did not see clear change.3 d group was smaller vacuoles，part of the nucleus to one side，and starting from 1 week liver tissue that was dramatically increasing number of large circular cavity.The levels of TG，VLDL in the serum were moderately elevated in 8 h，24 h groups，the most obvious was elevated in 3 d group，and begin to decline from 1 week. Serum levels of TCH，HDL in RIF-treated groups were relatively lower than control group.The liver TG levels significantly increased from 8 h，and peaked in 1 week group，then presented downward trend in 2 weeks and 4 weeks groups but higher than control group.The results of oil red O staining showed that 8 h and 24 h after RIF treatment，there was a small amount of lipid deposition in the liver，and large circular lipid drops in liver tissue dramatically increased after 3 d.ConclusionAdministration of rifampicin causes hepatic steatosis in mice and shows the obvious time-effect relationship.
mice；rifampicin；fatty liver；hepatic steatosis
R 575.5；R 978.3
A
1000－1492（2015）07－0937－05
2015－04－14接收
國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81001480）；2013年高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)（編號(hào)：20133420110005）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085MH120）；安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2011A159）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目（編號(hào)：2011SQRL058ZD）
1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230022
2安徽醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生毒理學(xué)系，合肥 230032
黃家惠，女，碩士研究生；陳 熙，女，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ayfychenxi＠gmail.com
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