劉 輝，余宏鑄，韓 瓏，王正林

TLR4 mAb對(duì)人正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞LPS-TLR4-NF-κB通路的影響

劉 輝，余宏鑄，韓 瓏，王正林

目的對(duì)脂多糖（LPS）及Toll樣受體4單克隆抗體（TLR4 mAb）作用于體外培養(yǎng)的人肝內(nèi)膽管細(xì)胞（HiBEC）后其TLR4 mRNA和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。方法體外培養(yǎng)HiBEC，采用RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)LPS和不同濃度的TLR4 mAb作用后，HiBEC細(xì)胞株中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果LPS可以上調(diào)HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)（P＜0.05）；而LPS作用于TLR4 mAb處理后的HiBEC中其TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)下調(diào)；高質(zhì)量濃度TLR4 mAb使NF-κB mRNA的表達(dá)下調(diào)更明顯（P＜0.05）。結(jié)論LPS能上調(diào)HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)；而TLR4 mAb則能拮抗LPS對(duì)HiBEC的刺激作用，下調(diào)TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達(dá)。

脂多糖；Toll樣受體4單克隆抗體；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一類來(lái)源于肝內(nèi)二級(jí)膽管以上的膽管上皮細(xì)胞惡性腫瘤［1］，在原發(fā)性肝癌中占第二位，約為5%～30%，僅次于肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。臺(tái)灣超過(guò)70%的ICC患者合并肝內(nèi)膽管結(jié)石，日本6%～8%的ICC患者手術(shù)切除標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了肝內(nèi)膽管結(jié)石。研究［2］顯示，肝內(nèi)膽管結(jié)石患者中有3%～10%的患者最終會(huì)發(fā)生ICC，肝內(nèi)膽管結(jié)石是ICC的危險(xiǎn)因素之一。關(guān)于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）-Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）經(jīng)典炎癥通路在人肝內(nèi)膽管細(xì)胞（human intrahepatic biliary epithelial cell，HiBEC）中的作用研究［3－5］較少。該試驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)，研究LPS 及TLR4單克隆抗體（TLR4 monoclonal antibodies，TLR4 mAb）作用于體外培養(yǎng)的HiBEC后其的TLR4 和NF-κB的表達(dá)情況，以探討LPS是否通過(guò)TLR4影響HiBEC中TLR4和NF-κB的表達(dá)情況以及LPS-TLR4-NF-κB通路在HiBEC中的作用，為下一步尋找特異性的藥物阻止受膽管結(jié)石長(zhǎng)期刺激的膽管壁細(xì)胞發(fā)生癌變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑HiBEC購(gòu)自上海雷蒂生物科技發(fā)展有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；四季青胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物技術(shù)公司；LPS、DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TLR4 mAb購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PCR反應(yīng)液6×Loading buffer購(gòu)自日本TaKa-Ra公司；氯仿、無(wú)水乙醇溶液、異丙醇溶液均購(gòu)自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；核酸染料goldview購(gòu)自北京賽百盛公司；所有引物由primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成（表1）。所有儀器由安徽醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 HiBEC培養(yǎng) RPMI-1640培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml鏈霉素為完全培養(yǎng)基，將HiBEC接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%，換成不含青霉素、鏈霉素，含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示HiBEC在4 μg／ml LPS、1 μg／ml TLR4 mAb、3 μg／ml TLR4 mAb作用24 h的條件下，活性沒(méi)有產(chǎn)生不可逆性改變，細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有發(fā)生改變，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，細(xì)胞核未見萎縮。將HiBEC培養(yǎng)至第4代，然后分成以下6組：對(duì)照組（僅加培養(yǎng)液）；A組（加入終質(zhì)量濃度為4 μg／ml的LPS）；B組（加入終質(zhì)量濃度為1 μg／ml TLR4 mAb）；C組（加入終質(zhì)量濃度為3 μg／ml的TLR4 mAb）；D組（終質(zhì)量濃度為1 μg／ml的TLR4 mAb預(yù)處理24 h，再加入終質(zhì)量濃度為4 μg／ml的LPS作用6 h）；E組（終質(zhì)量濃度為3 μg／ml的TLR4 mAb預(yù)處理24 h，再加入終質(zhì)量濃度為4 μg／ml的LPS作用6 h）。將以上6組細(xì)胞放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 收集細(xì)胞于1.5 ml離心管內(nèi)，去除上層培養(yǎng)液。加入TRIzol試劑充分裂解，依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇溶液，4℃離心，棄上清液，室溫干燥30 min后用30～50 μl DEPC水溶解，在55℃下促進(jìn)溶解10 min，置于－80℃保存?zhèn)溆?。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再行RT-PCR，用比較Ct法（ΔΔCt）分析結(jié)果。TLR4、NF-κB和GAPDH引物見表1。

表1 TLR4、NF-κB和GAPDH引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TLR4 mRNA的表達(dá)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，A組LPS作用于HiBEC后，TLR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；而B、C、D、E組TLR4 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與A組比較，B、C、D、E組TLR4 mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）；B組和C組TLR4 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D組和E組TLR4 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1A。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝69.989，P＜0.05）。

2.2 NF-κB mRNA的表達(dá)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，A組LPS作用于HiBEC后，NF-κB mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與A組比較，B、C、D、E組NF-κB mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P ＜0.05）；與D組比較，E組NF-κB mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。見圖1B。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝31.737，P＜0.05）。NF-κB的擴(kuò)增曲線見圖2。

3 討論

通常情況下，炎癥通過(guò)聚集炎癥細(xì)胞來(lái)保護(hù)感染或受損組織，同時(shí)將其隔離，以防止感染的擴(kuò)散，并且一旦炎癥消退，正常組織功能通?？梢曰謴?fù)。然而，在某些情況下，炎癥無(wú)法消退，長(zhǎng)期慢性炎癥刺激可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和血管生成［6］。膽道感染主要以革蘭陰性細(xì)菌感染為主，而LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要成分，也是致病的主要成分。LPS、LPS結(jié)合蛋白、CD14形成三體復(fù)合物后可以結(jié)合TLR4／髓樣分化蛋白2復(fù)合體，將LPS的刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一種可以介導(dǎo)機(jī)體損傷修復(fù)的細(xì)胞表面感受器，在癌細(xì)胞的免疫逃逸中起重要作用。TLR4是TLRs中的一種亞型，在腫瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)率是TLRs中最高的，推測(cè)其在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用［7］。TLR4與LPS結(jié)合后可以激活NF-κB，激活的NF-κB與炎癥，細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。NF-κB是致癌物質(zhì)的主要傳感器之一［8］。

研究［9］顯示TLR4和NF-κB在肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)的ICC組織中呈高表達(dá)。這表明TLR4和NF-κB 在HiBEC癌變的過(guò)程中起著重要的作用。TLR4 mAb可以結(jié)合HiBEC細(xì)胞上的TLR4，從而阻止LPS與TLR4的結(jié)合，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化及相應(yīng)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。研究［10－11］顯示下調(diào)NF-κB的表達(dá)可以向下調(diào)節(jié)炎癥并由此向下調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的整個(gè)過(guò)程，因此NF-κB抑制劑具有潛在的預(yù)防和治療癌癥的作用。

Yung et al［12］通過(guò)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株TSGH 9201，發(fā)現(xiàn)TLR4、p38 MARK和NF-κB的激活可以上調(diào)抵抗素誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）。SDF-1參與了胃癌的發(fā)生，刺激血管生成，有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。而TLR4競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑可以抑制TLR4，下調(diào)NF-κB的表達(dá)，抑制抵抗素誘導(dǎo)的SDF-1的表達(dá)。Yung et al認(rèn)為抑制TLR4可能是治療抵抗素導(dǎo)致的胃癌的治療方法。本研究顯示，LPS（4 μg／ml）作用于HiBEC 6 h后，TLR4和NF-κB表達(dá)水平明顯增加。由此推測(cè)HiBEC中LPS的作用機(jī)制可能是通過(guò)LPS-TLR4-NF-κB通路將LPS刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB磷酸化和核轉(zhuǎn)位［13］。為證實(shí)這一推測(cè)，本研究將TLR4 mAb作為TLR4的阻斷劑，對(duì)LPS-TLR4-NF-κB這一重要通路進(jìn)行封閉。結(jié)果顯示采用LPS（4 μg／ml）作用于TLR4 mAb預(yù)處理之后的HiBEC，其TLR4較A組表達(dá)下調(diào)；且LPS作用于不同質(zhì)量濃度TLR4 mAb預(yù)處理之后的HiBEC，TLR4的表達(dá)隨TLR4 mAb濃度的升高而進(jìn)一步下調(diào)，但兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在用LPS對(duì)HiBEC進(jìn)行刺激之前給予TLR4 mAb預(yù)處理24 h，則其NF-κB表達(dá)較A組下調(diào)，提示TLR4 mAb的作用機(jī)制可能是通過(guò)預(yù)先與HiBEC表面的TLR4結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，使得后來(lái)的LPS不能與TLR4結(jié)合，進(jìn)而阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響LPS刺激后產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥因子。本研究還顯示NF-κB在E組中表達(dá)較D組下調(diào)（P＜0.05），推測(cè)可能存在量效關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明LPS可能是通過(guò)LPS-TLR4-NF-κB通路上調(diào)TLR4和NF-κB的表達(dá)，并可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而TLR4 mAb可以拮抗LPS對(duì)HiBEC的刺激作用，阻止細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。

綜上所述，本研究提示LPS作用于體外培養(yǎng)的HiBEC后，TLR4 mRNA和NF-κB mRNA表達(dá)上調(diào)；使用TLR4 mAb后能拮抗LPS對(duì)HiBEC中TLR4 和NF-κB的作用。推測(cè)LPS對(duì)TLR4和NF-κB的影響可能是通過(guò)結(jié)合HiBEC表面TLR4來(lái)實(shí)現(xiàn)，而TLR4 mAb可以封閉細(xì)胞膜上的TLR4受體，進(jìn)而阻止LPS向HiBEC內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)NF-κB的表達(dá)。本研究結(jié)果為研制新的抗LPS藥物提供了一定的理論依據(jù)；為下一步尋找特異性的藥物阻止受膽管結(jié)石長(zhǎng)期刺激的膽管壁細(xì)胞發(fā)生癌變提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of TLR4 mAb on the normal intrahepatic of bile duct epithelial cells of human LPS-TLR4-NF-κB pathway

Liu Hui，Yu Hongzhu，Han Long，et al
（Dept of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the expression of Toll-like receptor 4（TLR4），nuclear factor-κB（NF-κB）induced by lipopolysaccharide（LPS）and Toll-like receptor 4 monoclonal antibodies（TLR4 mAb）in normal human intrahepatic biliary epithelial cells（HiBEC）in vitro.MethodsWe cultured HiBEC in vitro.The cells were stimulated by LPS and different concentrations of TLR4 mAb.The levels of mRNA expression of TLR4 and NF-κB were detected by reverse transcription PCR（RT-PCR）.ResultsLPS increased the mRNA expression of TLR4 and NF-κB（P＜0.05）.TLR4 mAb reduced the mRNA expression of TLR4 and NF-κB（P＜0.05）after LPS-stimulated HiBEC.High concentrations of TLR4 mAb reduced the mRNA expression of NF-κB（P＜0.05）after LPS-stimulated HiBEC in vitro.ConclusionThe mRNA expression of TLR4 and NF-κB is increased afer LPS-stimulated Hi-BEC.TLR4 mAb antagonize the role of LPS on TLR4 and NF-κB，and reduce the mRNA expression of TLR4 and NF-κB.

lipopolysaccharide；Toll-like receptor 4 monoclonal antibodies；Toll-like receptor 4；nuclear factorκB

R 349.54

A

1000－1492（2015）07－0946－04

2015－04－23接收

2013年安徽省年度重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：1301043034）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，合肥 230022

劉 輝，男，碩士研究生；余宏鑄，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hong-Zhu.620929＠aliyun.com