魏 巍，吳華勛，付靜靜，袁平凡，魏偉

選擇性β腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)人滑膜細(xì)胞增殖能力的影響

魏 巍，吳華勛，付靜靜，袁平凡，魏偉

目的觀察β-腎上腺素受體（AR）激動(dòng)藥對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）增殖的作用，探討β-AR信號(hào)對(duì)人FLS功能的影響。方法組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人FLS；使用腫瘤壞死因子α（TNF-α）作為刺激劑，MTT法分別檢測(cè)β1-AR選擇性激動(dòng)劑多巴酚丁胺和β2-AR選擇性激動(dòng)劑沙丁胺醇對(duì)人FLS增殖作用的影響，并計(jì)算增殖抑制率；使用沙丁胺醇＋β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551觀察其對(duì)FLS增殖功能的影響；Western blot法檢測(cè)人FLS β-AR、G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（GRK2）和β抑制蛋白2（β-arrestin2）胞膜蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果TNF-α可以顯著促進(jìn)人FLS的增殖；β2-AR激動(dòng)劑沙丁胺醇能明顯抑制FLS的增殖，其拮抗劑ICI 118551能顯著拮抗沙丁胺醇的作用；β1-AR選擇性激動(dòng)劑多巴酚丁胺對(duì)FLS的增殖無(wú)顯著影響；TNF-α和沙丁胺醇均能顯著降低β2-AR胞膜表達(dá)，上調(diào)GRK2、β-arrestin2的胞膜表達(dá)。結(jié)論β2-AR信號(hào)的激活可以抑制FLS增殖；TNF-α和沙丁胺醇可以使GRK2、β-arrestin2的胞膜表達(dá)增加，β2-AR胸膜表達(dá)下降。

腎上腺素受體；成纖維樣滑膜細(xì)胞；沙丁胺醇；增殖

腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）作為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵受體，可能參與了類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［1］。AR屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，AR分為α1-AR、α2-AR、β-AR。β-AR分為3個(gè)亞型，即β1-AR、β2-AR、β3-AR［2］。其中β2-AR在炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮抗炎作用，可以抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）產(chǎn)生、抑制白細(xì)胞黏附、降低毛細(xì)血管通透性等［3－4］。β-AR介導(dǎo)的信號(hào)通路可能受到G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（G-protein-coupled receptor kinases，GRK2）和β抑制蛋白2（β-arrestin2）的調(diào)節(jié)［5］。β-AR活化后會(huì)被GRK2磷酸化，而后β-arrestin 2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜與磷酸化的受體結(jié)合，使該受體與G蛋白脫偶聯(lián)，從而促進(jìn)β-AR內(nèi)化和脫敏［6］。在β-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，GRK2／β-arrestin2是β-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控分子，直接影響下游信號(hào)分子的效應(yīng)［7］。該研究通過(guò)觀察β1-AR選擇性激動(dòng)劑多巴酚丁胺和β2-AR選擇性激動(dòng)劑沙丁胺醇及其選擇性的受體拮抗劑對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）的增殖功能等的影響，及β-AR信號(hào)在人FLS中的變化，探討β-AR信號(hào)對(duì)人FLS的調(diào)節(jié)作用及部分可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年8月～2013年8月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換及關(guān)節(jié)鏡術(shù)中所取的10例正常關(guān)節(jié)滑膜組織。全部來(lái)源于膝關(guān)節(jié)半月板損傷患者，男6例，女4例；年齡18～37（23±5.8）歲，經(jīng)診斷無(wú)其他關(guān)節(jié)病變，取正?；そM織，試驗(yàn)得到所有對(duì)象的知情同意。

1.2 試劑β1-AR選擇性激動(dòng)劑多巴酚丁胺購(gòu)自浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司；β2-AR選擇性激動(dòng)劑沙丁胺醇購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MTT以PBS配制成所需濃度，過(guò)濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配；兔源性抗β1-AR抗體和兔源性抗β2-AR抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；兔源性抗GRK2抗體和兔源性抗β-arrestin2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化酶羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α購(gòu)自上海達(dá)科為生物制品有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細(xì)胞分離、培養(yǎng) 采用滑膜細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)法［8］：將前述收取的滑膜組織放入有PBS的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，在超凈臺(tái)內(nèi)棄PBS，用D-Hank’s液（無(wú)Ca2＋、Mg2＋，含青霉素200 mg／L、鏈霉素200 mg／L）反復(fù)沖洗后剪成1～2 mm2小塊，用彎頭吸管吸取均勻排列于培養(yǎng)瓶（預(yù)先用含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液濕潤(rùn)）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使其貼壁。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3 d換1次培養(yǎng)液，觀察到有大量成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞快長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 FLS增殖反應(yīng)的測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)增殖反應(yīng)。人第3代滑膜細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液（5×106個(gè)／ml），加至96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：正常組、TNF-α（20 ng／ml）刺激組、TNF-α＋多巴酚丁胺（10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）組、TNF-α＋沙丁胺醇（10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）組，培養(yǎng)12、24、48、72 h。終止培養(yǎng)前4 h各孔加MTT（5 g／L）溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，加入DMSO（100 μl／孔），振蕩3 min后于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（absorbance，A）值。每組以復(fù)孔的均值表示其結(jié)果。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的時(shí)間、濃度，給予β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551觀察其對(duì)人FLS增殖的影響。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)FLS的β1-AR、β2-AR、GRK2和β-arrestin2胞膜蛋白的表達(dá) 取第3代FLS，以每孔1×106細(xì)胞密度接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為：正常組、沙丁胺醇（10－6mol／L）組、TNF-α（20 ng／ml）組、TNF-α＋沙丁胺醇（10－6mol／L）組。培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液后超聲降解，提取總蛋白，100 000 r／min離心1 h，沉淀物為胞膜蛋白，用裂解液溶解，加入上樣緩沖液煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAEG電泳（5%的濃縮膠和10%的分離膠），轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h，分別加入抗β1-AR、β2-AR、GRK2或β-arrestin2（1∶1 000）抗體，內(nèi)參用β-actin單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶30 000），37℃孵育2 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來(lái)表示蛋白相對(duì)表達(dá)量［9］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 β-AR選擇性激動(dòng)劑對(duì)FLS增殖能力的影響與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以明顯促進(jìn)人FLS的增殖能力，沙丁胺醇在12、24、48 h可不同程度的抑制FLS亢進(jìn)的增殖功能，而多巴酚丁胺對(duì)FLS的增殖無(wú)明顯影響。沙丁胺醇（10－6mol／L）在24 h有較高的增殖抑制率。見(jiàn)圖1、2。

2.2 β2-AR選擇性拮抗劑對(duì)人FLS增殖能力的影響與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以顯著促進(jìn)FLS的增殖（P＝0.004），沙丁胺醇（10－6mol／L）能顯著抑制FLS亢進(jìn)的增殖能力（P＝0.022），β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551（10－6mol／L）能顯著拮抗沙丁胺醇（10－6mol／L）對(duì)FLS的抑制作用（P ＝0.006）。見(jiàn)圖3。

2.3 Western blot法檢測(cè)FLS β1-AR、β2-AR、GRK2、β-arrestin2的變化與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以顯著降低胞膜中β2-AR的表達(dá)（P ＝0.007）；升高胞膜中GRK2（P＝0.034）、β-arrestin2（P＝0.008）的表達(dá)。與TNF-α單獨(dú)刺激組比較，TNF-α（20 ng／ml）＋沙丁胺醇（10－6mol／L）組可以進(jìn)一步降低胞膜中β2-AR的表達(dá)（P＝0.023）；升高胞膜中GRK2（P＝0.015）、β-arrestin2（P＝0.034）的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

β-AR是一類(lèi)典型的GPCRs，是人體內(nèi)具有復(fù)雜生理功能的受體，與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如心血管疾病、自身免疫病等，其功能受GRK2等的調(diào)節(jié)。β2-AR以激動(dòng)劑依賴(lài)方式與GRK2結(jié)合并磷酸化，另一蛋白家族視紫紅質(zhì)抑制蛋白（arrestin）與磷酸化的β-AR結(jié)合，得β-AR與Gαs蛋白解偶聯(lián)，導(dǎo)致受體功能減退（即同源脫敏）［10］，通過(guò)G蛋白-AC-cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一系列反應(yīng)，將胞外信號(hào)傳達(dá)到胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能［8］。其中β2-AR主要偶聯(lián)Gs蛋白，該受體的活化能激活A(yù)C，升高cAMP的水平，進(jìn)一步激活PKA而發(fā)揮效應(yīng)，如抑制白細(xì)胞黏附、降低毛細(xì)血管通透性等。β2-AR的激活可以抑制很多炎癥反應(yīng)，如在自身免疫性心肌炎中，β2-AR信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能發(fā)揮抑制作用［11］。那么β2-AR信號(hào)是否對(duì)FLS的功能具有調(diào)節(jié)作用呢？本研究結(jié)果提示β2-AR激動(dòng)藥可以抑制FLS增殖，而β1-AR激動(dòng)藥對(duì)FLS增殖無(wú)明顯影響。

TNF-α（20 ng／ml）可以顯著降低胞膜中β2-AR的表達(dá)，升高胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達(dá)；TNF-α＋沙丁胺醇（10－6mol／L）可以進(jìn)一步降低胞膜中β2-AR的表達(dá)，升高胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達(dá)，兩者作用趨勢(shì)一致，但TNF-α刺激增殖，而沙丁胺醇抑制增殖。因?yàn)樯扯“反际铅?-AR選擇性激動(dòng)劑，刺激β2-AR，升高cAMP的水平。可能與cAMP升高，抑制滑膜細(xì)胞增殖有關(guān)。

GRK2、β-arrestin2是β-AR脫敏典型的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。β-AR被配體激活后，會(huì)被GRK2在絲、蘇氨酸位點(diǎn)快速磷酸化，磷酸化的β-AR與轉(zhuǎn)移至胞膜的β-arrestin2結(jié)合，使該受體與G蛋白脫偶聯(lián)，從而促進(jìn)β-AR的內(nèi)化和脫敏，通過(guò)脫敏β-AR，終止G蛋白介導(dǎo)的下游信號(hào)，影響cAMP的水平［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α活化后的FLS經(jīng)沙丁胺醇作用后，由于脫敏作用β2-AR胞膜表達(dá)明顯下降，而β2-AR負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白GRK2、β-arrestin2在胞膜中表達(dá)顯著升高，提示GRK2、β-arrestin2轉(zhuǎn)膜的增加，導(dǎo)致β2-AR脫敏的增強(qiáng)，可能是β2-AR胞膜表達(dá)下降主要原因。

［1］ Koopman F A，Stoof S P，Straub R H，et al.Restoring the balance of the autonomic nervous system as an innovative approach to the treatment of rheumatoid arthritis［J］.Mol Med，2011，17（9－10）：937－48.

［2］ 汪慶童，馬昱琨，黃 蓓，等.芍藥苷通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺素E2受體抑制大鼠成纖維滑膜細(xì)胞增殖［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（1）：43－7.

［3］ Zhu W，Woo A Y，Zhang Y，et al.β-adrenergic receptor subtype signaling in the heart：from bench to the bedside［J］.Curr Top Membr，2011，67：191－204.

［4］ Chottová D M，Slavíková J.Adrenergic regulation of the mammalian heart［J］.Cesk Fysiol，2011，60（1）：14－9.

［5］ Mishima K，Otani H，Tanabe T，et al.Molecular mechanisms for alpha2-adrenoceptor-mediated regulation of synoviocyte populations ［J］.Jpn J Pharmacol，2001，85（3）：214－26.

［6］ Homan K T，Glukhova A，Tesmer J J.Regulation of G proteincoupled receptor kinases by phospholipids［J］.Curr Med Chem，2013，20（1）：39－46.

［7］ Lymperopoulos A.GRK2 and β-arrestins in cardiovascular disease：Something old，something new［J］.Am J Cardiovasc Dis，2011，1（2）：126－37.

［8］ Han S O，Kommaddi R P，Shenoy S K.Distinct roles for β-arrestin2 and arrestin-domain-containing proteins in β2adrenergic receptortrafficking［J］.EMBO Rep，2013，14（2）：164－71.

［9］ Morris A J，Malbon C C.Physiological regulation of G proteinlinked signaling［J］.Physiol Rev，1999，79（4）：1347－430.

［10］Zhao W，Tong T，Wang L，et al.Chicken type II collagen induced immune tolerance of mesenteric lymph node lymphocytes by enhancing beta2-adrenergic receptor desensitization in rats with collageninduced arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（1）：12－8.

［11］Zhang P，He X，Tan J，et al.β-arrestin2 mediates β2adrenergic receptor signaling inducing prostate cancer cell progression［J］. Oncol Rep，2011，26（6）：1471－7.

［12］趙 偉，童 彤，馬 勇，等.雞Ⅱ型膠原對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腸系膜淋巴結(jié)β2腎上腺素受體脫敏的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（3）：249－53.

The effects of the selective β-adrenergic receptor agonists on the ability of human synovial cell proliferation

Wei Wei，Wu Huaxun，F(xiàn)u Jingjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine of Education Ministry，Hefei 230032）

ObjectiveTo observe the function of β-adrenergic receptor（AR）agonists on human fibroblasts synoviocytes（FLS）proliferation and explore the effect of β-AR signaling on FLS function.MethodsTissue culturing method cultured human FLS；using TNF-α as a stimulant；MTT method was used to detect the effect of β1-AR selective agonist dobutamine and β2-AR selective agonist salbutamol on the proliferation of human FLS，and calculate the proliferation inhibition rate.β2-AR selective antagonist ICI 118551 was used to observe the effect on FLS proliferation；Western blot method could detect cell membrane protein expression level belonged to FLS β-AR，GRK2 and β-arrestin2 on human.ResultsTNF-α could significantly promote the proliferation of FLS on human，β2-AR agonist salbutamol could significantly inhibit the proliferation of FLS，and its antagonist ICI 118551 could significantly inhibit salbutamol action.β1-AR selective agonist dobutamine had no significant effect on the proliferation of FLS；TNF-α and salbutamol significantly decreased β2-AR expression of cell membrane，and up-regulated GRK2 and β-arrestin2 expression in cell membrane.ConclusionThe activation of β2-AR signal can inhibit the proliferation of FLS；TNF-α and salbutamol can increase the expression of GRK2，β-arrestin2，and decrease the expression of β2-AR in cell membrane.

adrenergic receptor；fibroblast-like synoviocytes；albuterol sulfate；desensitization

R 967

A

1000－1492（2015）07－0978－04

2015－03－20接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81173075，81330081，81302784）；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：1301042098）

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230032

魏 巍，女，碩士研究生；魏 偉，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn