賈 真

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000)

紅景天苷對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用*

賈 真

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 南陽(yáng) 473000)

目的：研究紅景天苷對(duì)大鼠急性心肌缺血保護(hù)作用，初步探討其機(jī)制。方法：將48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、紅景天苷組,每組16只。紅景天苷組每天自大鼠尾靜脈注射紅景天苷10 μg/(g·d)，假手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，連續(xù)腹腔注射7 d。末次注射30 min后制備心肌缺血再灌注模型(缺血30 min,再灌注1 h)。大鼠腹主動(dòng)脈取血，制備血清，檢測(cè)血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量；TUNEL法檢測(cè)各組大鼠缺血心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；免疫組化法檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2 、Bax表達(dá)和Bcl-2/Bax比值。結(jié)果： 與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組血清中CK-MB活性及MDA含量降低， SOD活性升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax的表達(dá)降低，凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-2/Bax上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 紅景天苷能通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等機(jī)制，保護(hù)大鼠急性缺血心肌。

紅景天苷/藥效學(xué)；急性心肌缺血/藥效作用；心肌細(xì)胞凋亡/藥物作用；脂質(zhì)過(guò)氧化/分析；大鼠；動(dòng)物模型

紅景天苷是藏藥紅景天的提取物，具有良好的抗缺氧、抗腫瘤、抗衰老作用[1]。紅景天苷在心血管方面作用諸多，關(guān)于其對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷的影響，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，以氧化應(yīng)激、心肌酶、心肌細(xì)胞凋亡為觀察指標(biāo)，研究紅景天苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷干預(yù)機(jī)制，為臨床缺血性心臟病干預(yù)開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

48只SD大鼠，6～7周齡，雌雄各半，體質(zhì)量225～260 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXC(豫)2014-0063。

1.2 藥品、試劑與儀器

注射液紅景天苷，純度>90%，購(gòu)自成都恒基醫(yī)藥科技公司，批號(hào)20140361。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) 和 肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒，購(gòu)自南京碧波生物科技有限公司，批號(hào)依次20140316，20140403，20140506； TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Bcl-2、Bax(凋亡蛋白)試劑盒，購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20140401，20140501。 BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；BF52-OLYMPUS熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；7020全自動(dòng)生化分析儀， 日立公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與模型的建立

將48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、紅景天苷組，每組16只。術(shù)前紅景天苷組每天自大鼠尾靜脈注射紅景天苷10 μg/(g·d)，假手術(shù)組和模型對(duì)照組注射等量生理鹽水,連續(xù)腹腔注射7 d。末次注射30 min后制備心肌缺血再灌注模型[2]。先稱量體質(zhì)量，以30 g/L戊巴比妥鈉(40 μg/g)行腹腔注射麻醉后仰臥位固定；常規(guī)氣管插管及開(kāi)胸，完全暴露心臟；假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不結(jié)扎，其余2組以5-0號(hào)絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌顏色先變白而后變紫紺為結(jié)扎成功；結(jié)扎30 min后松開(kāi)扎線，再灌注1 h；采集腹主動(dòng)脈血3 mL；處死大鼠，迅速取出心臟。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 CK-MB、SOD活性及MDA含量

以 3 000 r/min 離心血液10 min，取血清，用7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)CK-MB、SOD活性及MDA含量

1.4.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax

取大鼠缺血心肌，常規(guī)固定、包埋和制片。

采用 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)：操作步驟按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB顯色，熒光顯微鏡顯示未凋亡心肌細(xì)胞發(fā)藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核發(fā)綠色熒光。在200倍視野下，選擇缺血最顯著區(qū)5個(gè)無(wú)重疊視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。AI=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

采用免疫組化法檢測(cè)心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組CK-MB、SOD活性及MDA含量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清CK-MB、MDA含量升高，SOD活性降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組血清CK-MB活性及MDA含量降低， SOD活性升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組 別SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)CK-MB/(U·mL-1)假手術(shù)組145.35±7.962.27±0.780.75±0.28模型對(duì)照組86.21±3.76*7.61±1.36*6.29±1.18*紅景天苷組119.19±6.51#3.13±1.05#2.7±1.25#

注：與假手術(shù)組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠AI、Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax對(duì)比

假手術(shù)組可見(jiàn)少量散在綠色熒光細(xì)胞核，模型對(duì)照組綠色熒光細(xì)胞數(shù)顯著增多，紅景天苷組綠色熒光細(xì)胞核較模型對(duì)照組減少。提示：紅景天苷干預(yù)后大鼠心肌凋亡細(xì)胞明顯減少。與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠AI升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組AI下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升，Bcl-2/Bax比值下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組Bcl-2表達(dá)上升， Bax表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組 別AI/%Bcl-2/%Bax/%Bcl-2/Bax假手術(shù)組2.45±0.951.57±0.020.46±0.023.42±0.02模型對(duì)照組20.15±1.17*0.65±0.04*0.94±0.05*0.68±0.05*紅景天苷組15.66±2.05#0.88±0.03#0.77±0.03#1.22±0.04#

注：與假手術(shù)組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

3 討 論

缺血再灌注導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制較為復(fù)雜。國(guó)內(nèi)外學(xué)者[3-5]認(rèn)為：這種病理過(guò)程與炎癥反應(yīng)、鈣超載等有關(guān)。除此之外，氧化應(yīng)激損傷在缺血再灌注過(guò)程中作用至關(guān)重要。心肌缺血后再灌注時(shí)可產(chǎn)生大量氧自由基，而內(nèi)源性氧自由基清除酶顯著減少，就會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)損傷，隨之使MDA劇烈釋放，使血清中含量增加；因此，MDA可以體現(xiàn)超氧化反應(yīng)的程度，也是對(duì)細(xì)胞受損程度的一種間接性體現(xiàn)。心肌細(xì)胞膜整體性遭到損壞的時(shí)候，內(nèi)源性CK-MB即放出進(jìn)入血液內(nèi)，CK-MB活性可以做判別心肌細(xì)胞遭受損壞水平的敏感參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組血清SOD活性升高，血清MDA、CK-MB活性降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示紅景天苷可清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。缺血再灌注后心肌組織也受到損傷，其損傷形式是細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組對(duì)比，紅景天苷組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高， Bax表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示紅景天苷能抑制急性心肌缺血導(dǎo)致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也與譚紅玲等[6]的研究一致。

[1]滕靜如，熊佳鵬，肖成，等.紅景天的現(xiàn)代藥理學(xué)進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)雜志，2006,12(4)：319.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修,等.藥理實(shí)驗(yàn)學(xué)方法學(xué)[M]. 3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:567.

[3]Yang J,Chen L,Yang J,et al.MicroRNA-22 targeting CBP protectsagainst myocardial ischemia-reperfusion injury through anti-apoptosis in rats[J].Mol Biol Rep,2014,41(1):555-561.

[4]Skovsted GF,Kruse LS,Larsen R, et al. Heart ischaemia-reperfusion induces local up-regulation of vasoconstrictor endothel in ETB receptors in rat coronary arteries downstream of occlusion[J].Br J Pharmacol,2014,171(11):2726-2738

[5]高元峰，陳興，陳里新，等.紅景天苷對(duì)大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中南藥學(xué),2010,8(2):115-118.

[6]譚洪玲，肖成榮, 馬增春，等.紅景天苷對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的保護(hù)作用[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(3):194-197.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)08-0057-03 ·實(shí)驗(yàn)研究·

R542.2

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.08.28

南陽(yáng)市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012GG066)

2015-04-21；

2015-06-30