申 安，袁 洋，岳園園，張 穎，李曉天，張玉靜

(1.焦作市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450000)

真武膠囊安全性評(píng)價(jià)研究*

申 安1，袁 洋2，岳園園3，張 穎3，李曉天3，張玉靜3

(1.焦作市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450000)

目的：對(duì)真武膠囊的安全性進(jìn)行研究。方法：取40只KM小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和真武膠囊組2組，每組20只。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14g/(kg·d)，對(duì)照組給予羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)0.4 g /(kg·d)，灌胃給藥，1d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h，給藥期限為1 d。給藥后觀察動(dòng)物反應(yīng)，連續(xù)觀察15 d。另取SD大鼠160只進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CMC-Na 0.05 g/kg)，真武膠囊低劑量(1.71g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。觀察一般狀況，并檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)，對(duì)心臟、氣管、肺和胃組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果：急性毒性試驗(yàn)中所有動(dòng)物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，觀察期結(jié)束后對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行剖檢，肉眼觀察各臟器無(wú)明顯異常。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)在給藥后的觀察期內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況良好，血液學(xué)指標(biāo)、各臟器組織等均未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)。結(jié)論：真武膠囊具有較好的安全性。

真武膠囊/藥效學(xué)；安全性；毒性試驗(yàn)；動(dòng)物模型；小鼠

真武湯出自《傷寒論》,由附子、生姜、茯苓、白術(shù)、白芍組成，是為表證過(guò)汗傷陽(yáng)、少陰病陽(yáng)虛水泛病證而設(shè)的名方[1]。本研究采用新的配方比例首次將真武湯改為膠囊劑型，按照《藥品注冊(cè)管理辦法》新藥技術(shù)要求，對(duì)真武膠囊做臨床前安全性評(píng)價(jià)。

1 材 料

1.1 動(dòng) 物

急性毒性試驗(yàn)用動(dòng)物：經(jīng)檢疫合格的SPF級(jí)KM小鼠40只，雌雄各半,雄性體質(zhì)量18.8～24.6g，雌性體質(zhì)量18.0～22.5 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2010-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為1019164。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)用動(dòng)物：經(jīng)檢疫合格的SPF級(jí)SD大鼠160只，雌雄各半，雄性體質(zhì)量112.0～141.3g，雌性體質(zhì)量122.5～153.7g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)11400700022526。

1.2 藥品與試劑

真武膠囊，每粒膠囊含0.4 g膠囊粉，每克膠囊粉相當(dāng)于8.75 g生藥，由某制藥股份有限公司提供，批號(hào)130506。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)F20090113。

2 方法與結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組與給藥

將40只KM小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和真武膠囊組2組，每組20只，雌雄各半。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14 g/(kg·d)，對(duì)照組給予CMC-Na 0.4 g /(kg·d)，均灌胃給藥，1 d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h ，給藥期限為1 d。

2.1.2 檢測(cè)指標(biāo)

觀察給藥后動(dòng)物的一般狀況，稱量體質(zhì)量，記錄動(dòng)物中毒的表現(xiàn)和特點(diǎn)、毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失時(shí)間，以及動(dòng)物的死亡時(shí)間，并連續(xù)觀察15 d。

2.1.3 結(jié) 果

在給藥后的觀察期內(nèi)，所有動(dòng)物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，動(dòng)物無(wú)一例死亡。真武膠囊組動(dòng)物的體質(zhì)量與對(duì)照組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察期結(jié)束后對(duì)全部動(dòng)物進(jìn)行剖檢，肉眼觀察各臟器無(wú)明顯異常。

2.2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組與給藥

將160只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(CMC-Na 0.05 g/kg)、真武膠囊低劑量(1.71 g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，每組40只，雌雄各半[2]。均灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。

2.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

每天進(jìn)行一般狀況觀察，每周稱量2次體質(zhì)量，并于給藥90 d時(shí)進(jìn)行血液學(xué)、血清生化學(xué)以及病理學(xué)檢查。病理檢查根據(jù)鏡檢記錄進(jìn)行分析[3-5]。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.2.4 結(jié) 果

一般狀況及體質(zhì)量：各用藥組大鼠的一般狀況良好，未見(jiàn)明顯與藥物相關(guān)的毒性癥狀。各用藥組大鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組對(duì)比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

給藥90 d時(shí)各組雄性大鼠血液學(xué)指標(biāo)對(duì)比：與對(duì)照組對(duì)比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.01)、HGB水平降低(P<0.05)、PLT增高(P<0.05)，真武膠囊粉中劑量組RBC水平降低(P<0.05)，但以上指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，且未見(jiàn)與給藥劑量及進(jìn)程的相關(guān)性。各用藥組其余指標(biāo)與對(duì)照組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對(duì)照組0.0512.25±1.90174.10±25.04678.30±322.177.06±3.6117.018±5.2863.59±12.65真武膠囊高劑量組52.210.37±1.07**153.44±8.83*965.11±134.77*5.23±1.3215.66±3.7663.38±12.72真武膠囊中劑量組28.011.52±1.31*166.30±17.71922.00±323.555.40±2.1418.02±5.5766.04±11.83真武膠囊低劑量組15.011.92±0.89165.60±12.61832.50±251.437.98±3.0414.94±4.3172.86±7.39

注：與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01。

給藥90 d時(shí)各組雄性大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)對(duì)比：與對(duì)照組對(duì)比，真武膠囊粉高劑量組TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內(nèi)，且未見(jiàn)與給藥劑量及進(jìn)程的相關(guān)性。各用藥組其余指標(biāo)與對(duì)照組比較(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對(duì)照組0.0545.44±8.01112.60±19.4996.69±37.291.17±0.3069.78±4.3633.41±3.804.64±0.51真武膠囊高劑量組52.242.64±4.39107.50±22.44105.92±14.401.08±0.2665.53±5.97*31.31±4.124.27±0.55真武膠囊中劑量組28.041.73±4.19108.10±15.07102.00±14.251.15±0.3168.23±1.1632.58±2.634.63±0.48真武膠囊低劑量組15.043.96±7.45105.70±15.87108.38±7.571.19±0.3170.21±5.2032.82±3.984.47±0.50

注：與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。

給藥90 d時(shí)各組雌性大鼠血液學(xué)指標(biāo)對(duì)比：與對(duì)照組對(duì)比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.05)，HGB水平降低(P<0.05)，但二者均在正常值范圍內(nèi)，且未見(jiàn)與給藥劑量及進(jìn)程的相關(guān)性。各用藥組其余指標(biāo)與對(duì)照組比較(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對(duì)照組0.0510.14±1.96150.30±23.76900.70±240.833.88±1.2415.92±5.7573.08±9.25真武膠囊高劑量組52.29.14±1.06*138.20±12.74*995.90±154.713.63±1.7515.03±3.7876.85±6.02真武膠囊中劑量組28.09.56±1.25145.00±17.51854.60±240.073.67±1.3819.44±5.9370.36±8.36真武膠囊低劑量組15.09.32±2.45138.30±35.38895.10±315.524.33±2.7114.58±5.8870.05±9.05

注：與對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05。

給藥90 d時(shí)各組雌性大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)對(duì)比：與對(duì)照組對(duì)比，真武膠囊粉高劑量TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內(nèi)，且未見(jiàn)與給藥劑量及進(jìn)程的相關(guān)性。各用藥組其余指標(biāo)與對(duì)照組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對(duì)照組0.0543.1±5.70102.70±9.18103.10±14.421.22±0.2869.41±3.5332.94±2.484.43±0.60真武膠囊高劑量組52.245.69±3.76106.40±10.54110.57±12.841.34±0.2765.07±5.25*32.76±3.653.88±0.62真武膠囊中劑量組28.045.00±5.92107.80±9.52105.23±15.411.17±0.2469.08±4.8832.27±3.444.31±0.37真武膠囊低劑量組15.043.92±4.61101.92±9.55104.46±11.461.31±0.2375.37±8.4633.57±2.494.45±0.77

注：與對(duì)照組TP對(duì)比,真武膠囊高劑量組 *P<0.05。

病理檢查結(jié)果：動(dòng)物組織器官未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)，高劑量組大鼠心臟、氣管、肺和胃的病理切片見(jiàn)圖1～4。大鼠心肌纖維條紋清晰，無(wú)變性、壞死。氣管黏膜、黏膜下層和外膜結(jié)構(gòu)清楚。肺終末支氣管與肺泡組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁與肺泡腔內(nèi)均無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。胃黏膜皺襞清楚，被覆上皮完整，未見(jiàn)潰瘍、增生等改變。

圖1 心臟的病理切片(HE染色，×40)

圖2 氣管的病理切片(HE染色，×10)

圖3 肺的病理切片(HE染色，×20)

圖4 胃的病理切片(HE染色，×10)

3 討 論

真武膠囊是在傳統(tǒng)真武湯(由附子、生姜、茯苓、白術(shù)、白芍組成)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善藥物組方、改變劑型而研制出的藥物，與真武湯的治療作用一致，但較真武湯有服用方便、藥物穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。為了預(yù)測(cè)受試物可能引起的臨床不良反應(yīng)，為臨床試驗(yàn)中解毒或解救措施提供參考，筆者進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)所獲得的信息對(duì)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和藥物臨床試驗(yàn)起始劑量的選擇具有重要參考價(jià)值，并對(duì)了解其毒性靶器官和初步闡明藥物的毒性作用具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)條件下，一天內(nèi)灌胃給予小鼠57.14 g /kg真武膠囊生藥粉(相當(dāng)于擬用臨床劑量的104.1倍)，所有動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)可以用來(lái)推測(cè)第一次臨床試驗(yàn)的起始劑量，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供安全劑量范圍以及為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)及防治提供參考。本實(shí)驗(yàn)條件下，用真武膠囊粉給SD大鼠連續(xù)灌胃90 d，高劑量相當(dāng)于真武膠囊生藥粉52.2 g/(kg·d) ，相當(dāng)于臨床用量的85.3倍，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均未出現(xiàn)明顯的劑量及時(shí)間依賴性。

本研究結(jié)果顯示：真武膠囊組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，各項(xiàng)血液學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)變化也未見(jiàn)明顯劑量及時(shí)間依賴性，各組織器官未發(fā)現(xiàn)異常。表明真武膠囊具有良好的安全性，但其具體臨床安全性還有待于進(jìn)一步研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)08-0061-04 ·實(shí)驗(yàn)研究·

R286

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.08.30

李曉天，教授，博士后，lixt@zzu.edu.cn

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(13210231241)

2015-04-22；

2015-06-23