朱晨 方詩元*孔榮禹德萬黃炎夏睿徐瑋王英明馬銳祥劉應(yīng)生李雷李多玉

朱晨 方詩元*孔榮禹德萬黃炎夏睿徐瑋王英明馬銳祥劉應(yīng)生李雷李多玉

目的探討內(nèi)源性抗菌肽人 -防御素-3（HBD-3）聯(lián)合低頻超聲（US）及造影劑微泡（MB）的靶向破壞（UTMD）在體內(nèi)抑制耐藥葡萄球菌生物膜形成的作用。方法鈦片與2種耐藥葡萄球菌共培養(yǎng)24小時待生物膜形成后，放置于小鼠后背部脊柱皮下的兩側(cè)；再通過液體微量稀釋法，獲取HBD-3對2種耐藥菌的最小抑菌濃度（MIC）。48只小鼠按不同的處理?xiàng)l件隨機(jī)分為6組：（a）0 g/mLHBD-3；（b）超聲處理組；（c）微泡+超聲處理組；（d）10 MIC HBD-3；（e）10 MIC HBD-3+超聲處理組；（f）10 MIC HBD-3+超聲+微泡處理組。術(shù)后3天，處死各組小鼠取出鈦片。涂板計(jì)數(shù)、激光共聚焦顯微鏡及電子顯微鏡觀察不同實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件下，鈦片生物膜的厚度及膜內(nèi)的剩余活菌量。Realtime PCR定量分析相關(guān)成膜基因及耐藥基因，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與其它治療組相比，體內(nèi)最高濃度的HBD-3聯(lián)合UTMD組的活細(xì)菌數(shù)百分比明顯下降。同時，超聲微泡還能顯著提高HBD-3抑制成膜相關(guān)基因icaAD以及耐甲氧西林基因MecA的表達(dá)并同時促進(jìn)icaR的表達(dá)。結(jié)論UTMD可能有很大的潛力，提高HBD-3的抗菌活性并抑制小鼠體內(nèi)的生物膜感染。

超聲；微泡；葡萄球菌；生物膜； -防御素

做為條件致病菌，葡萄球菌已經(jīng)成為院內(nèi)感染以及骨科內(nèi)植物感染的主要致病菌[1]。大多數(shù)葡萄球菌的感染常合并生物膜形成，而生物膜內(nèi)的細(xì)菌對傳統(tǒng)的抗菌藥物高度耐藥。研究表明，US能顯著提高抗生素對浮游菌和生物膜內(nèi)細(xì)菌的殺滅作用[2]。MB造影劑能提供空化效應(yīng)并降低空化閾值，可以做為一種靶向藥物制劑[3]。UTMD通過提高細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性和代謝活性，增加氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，進(jìn)而提高抗生素對細(xì)菌的運(yùn)輸率，以增加抗生素的效果[3]。HBD-3是一種主要由人上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞或汗腺分泌的內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜和較穩(wěn)定的抗菌活性，對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant strains of Staphylococcusaureus,MRSA）甚至耐萬古霉素的糞腸球菌都有很強(qiáng)的抑制作用[4]。筆者以前的研究已表明，HBD-3或HBD-3聯(lián)合超聲靶向微泡破壞對耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin-resistant strains of Staphylococcus epidermidis, MRSE）和 MRSA在鈦片表面形成生物膜有明顯抑制作用[5,6]。然而，體內(nèi)聯(lián)合UTMD是否可以進(jìn)一步提高HBD-3對MRSA和MRSE已形成的生物膜具有抗菌效果，仍然未知。因此，本研究中筆者對UTMD聯(lián)合HBD-3，抑制在小鼠體內(nèi)植入物表面MRSA和MRSE生物膜的形成進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 菌株鑒定與HBD-3的抗菌活性

表皮葡萄球菌（ATCC35984）和金黃色葡萄球菌（ATCC 43300）購買于美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)庫。使用VITEK2自動化鑒定系統(tǒng)（BioMérieux,Marcy）進(jìn)行菌種的鑒定和藥敏試驗(yàn)。耐甲氧西林菌株的決定基因（A）證實(shí)2種菌株是否為MRSE或MRSA[7]。使用微孔板法（MTP）檢測形成生物膜的能力[8]。HBD-3（Sigma）以凍干粉的形式儲存，稀釋溶解于0.1%乙酸，并制備成1mg/mL的原液儲存。HBD-3的最低抑菌濃度（Minimuminhibitoryconcentration,MIC）由液體微量稀釋法進(jìn)行測定[9]。

1.2 超聲微泡的制備與生物膜處理

超聲源為US-100超聲理療康復(fù)治療儀（日本伊藤株式會社），其探頭為直徑30 mm的超聲波換能器，占空比5%～100%，聲強(qiáng)為100 mW/cm2～3W/cm2，頻率0.8MHZ。微泡造影劑聲諾維（Bracco）溶解在5 mL生理鹽水中，濃度為2×108～5×108MBs/mL。MBS的直徑為1～8 m（平均2.5 m），外層由磷脂組成，內(nèi)部封裝六氟化硫氣體[10]。過夜孵育的細(xì)菌稀釋1:1000，50L的2種細(xì)菌懸液（細(xì)菌數(shù)約106）被添加到含鈦片和0.2%（w/v）葡萄糖的0.5×BBL胰蛋白酶大豆肉湯（TSBG,BDBiosciences）中[11]。接種前，鈦板（厚1 mm，直徑10 mm）進(jìn)行滅菌，鈦片與細(xì)菌共培養(yǎng)24小時形成生物膜。

1.3 動物分組及涂平板計(jì)數(shù)法

BALB/c雄性小鼠，近交系，年齡為8～12周，48只小鼠隨機(jī)分為6組。腹腔注射麻醉，無菌條件下后背部皮膚切開，長度約10mm，鈦片表面生物膜形成后，放置于后背部皮下的兩側(cè)。分組：（a）0 g/mL HBD-3（未處理對照組）；（b）超聲處理組；（c）微泡+超聲處理組；（d）10MICHBD-3；（e）10 MIC HBD-3+超聲處理組和（f）10 MIC HBD-3+超聲+微泡處理組。HBD-3對2種不同菌株的MIC為：ATCC 35984（4 g/mL）和ATCC43300（8 g/mL）。10 MICHBD-3 /100lPBS皮下鈦片周圍注射，每天3次。HBD-3皮下注射后，立即局部應(yīng)用超聲靶向微泡或超聲20分鐘，每天3次。30 L的MB皮下注射到鈦片周圍，超聲波頻率為0.08 MHz、聲強(qiáng)為200mW/cm2、50%的占空比[3]。術(shù)后3天，6組不同的實(shí)驗(yàn)條件處理后12小時，處死各組小鼠取出鈦片。從眼眶后靜脈竇抽取血液樣本（2mL），進(jìn)行血培養(yǎng)；同時，血標(biāo)本倍比稀釋到BBL胰酪胨大豆瓊脂（TSA;BDBiosciences）表面進(jìn)行涂板，用于明確細(xì)菌從鈦片表面逃逸進(jìn)入血液中的浮游活菌數(shù)；同時，實(shí)驗(yàn)中鈦板表面的菌落形成單位（CFUs）的數(shù)量被用來確定在生物膜內(nèi)的剩余活菌。鈦片放入已消毒的含有0.5mL0.5×TSB的無菌試管中，通過超聲水浴震蕩收集細(xì)菌。然后進(jìn)行倍比稀釋至TSA涂板，24小時后計(jì)數(shù)分析，結(jié)果為細(xì)菌數(shù)/鈦片材料表面積（CFU/mm2）[12]。

1.4激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy, CLSM）及掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopes, SEM）觀察

實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件同上述涂平板計(jì)數(shù)法。取出小鼠體內(nèi)的覆蓋生物膜的鈦片進(jìn)行熒光染色。Live/Dead試劑盒含有兩種熒光染液，熒光染液 SYTO能使活細(xì)菌發(fā)出綠色熒光，PI可使死亡細(xì)菌發(fā)出紅色熒光。CLSM（LeicaTCS）下觀察材料表面生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)菌活力。死活細(xì)胞可以在熒光顯微鏡下被區(qū)分，活菌因完整的細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，而死菌因損壞的細(xì)胞膜而出現(xiàn)紅色熒光[13]。取出小鼠體內(nèi)覆蓋生物膜的鈦片用2.5%戊二醛溶液固定，梯度酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥并噴金。最后在SEM（JEOL JSM-6360LV）下觀察并拍照[13]。

1.5 Realtime定量分析

ATCC35984進(jìn)行成膜基因 AD及 R的表達(dá)分析。ATCC43300被選定為耐藥基因A的表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)條件同上述涂平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)方法。取出小鼠體內(nèi)的鈦片后，將上述各組鈦片表面的細(xì)菌生物膜使用超聲及無菌刮子收集，溶解于細(xì)菌RNA保護(hù)液（Qiagen）中，以保護(hù)細(xì)菌RNA的完整性（1.5 mL離心管）。然后離心管在4℃，8000g條件下離心8分鐘；棄去保護(hù)液，100 g/mL溶葡球菌酶（Sigma）的緩沖液200 L溶解菌珠。RNeasyminikit試劑盒（Qiagen）提取總RNA進(jìn)行純度測定。使用Fermentas RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后，根據(jù)Roche FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒操作說明，在ABI7500RealTimePCR（AppliedBiosystems）反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR操作，所用基因引物序列由上海生工生物合成。PCR擴(kuò)增條件：50°C，20秒1個循環(huán)；95°C，15秒，60°C，1分鐘，40個循環(huán)，最后95°C，10分鐘。16S rRNA為內(nèi)參基因，以每個樣品的CT值為基礎(chǔ)，每個樣品平均重復(fù)3次進(jìn)行測定[13]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 評估抑菌活性

ATCC35984及ATCC43300的MTP值分別為（0.962± 0.18）及（0.445±0.12），均大于0.240，且 A及A表達(dá)陽性，表明實(shí)驗(yàn)菌株為可形成生物膜的耐藥菌[8]。小鼠體內(nèi)鈦片表面每mm2ATCC35984和ATCC43300的計(jì)數(shù)在超聲處理組、超聲+微泡處理組和10 MIC HBD-3組，2個菌株鈦片表面的細(xì)菌數(shù)與對照組相比無顯著差異（＞0.05）。10 MIC HBD-3+超聲處理組和10 MIC HBD-3+超聲+微泡處理組，2個菌株鈦片表面的細(xì)菌數(shù)明顯低于對照組（＜0.05）。10 MICHBD-3+超聲+微泡處理組有最低的細(xì)菌量（＜0.05）。盡管鈦片表面大量的細(xì)菌生長，但6個實(shí)驗(yàn)組所有的血培養(yǎng)涂板計(jì)數(shù)均未見細(xì)菌生長。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組之間生物膜內(nèi)復(fù)蘇的活菌數(shù)量比較。數(shù)據(jù)表示為（±s）。*顯示2組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，＜0.05；#表示的無顯著差異，＞0.05

2.2 CLSM和SEM觀測

CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，在對照組中、超聲處理組和超聲+微泡處理組，可以觀察到高密度聚集的生物膜（圖2、圖3彩圖見插頁）。超聲+微泡處理組的生物膜表現(xiàn)出比超聲處理組和對照組更大的微孔。3個處理組包括10MICHBD-3，超聲處理組和超聲+微泡處理組，綠色熒光在鈦片表面明顯聚集形成。此外，HBD-3+超聲+微泡處理組比相同濃度HBD-3處理組或 HBD-3+超聲處理組生物膜內(nèi)檢測到更少的活菌。應(yīng)用SEM進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，以下3種條件下，即超聲處理組，超聲+微泡處理組和10 MIC HBD-3處理組，2株細(xì)菌鈦片表面仍聚集多個小菌落。相反，當(dāng)HBD-3聯(lián)合超聲或超聲+微泡進(jìn)行處理時，僅見一些小的、單菌落在鈦片表面生長。此外，在2種不同菌株的鈦片表面10 MIC HBD-3+超聲+微泡處理組比相同濃度的 HBD-3+超聲處理組有更少的菌落殘留（圖4、圖5）。

圖2 CLSM觀察 US聯(lián)合 MB在體內(nèi)增強(qiáng) HBD-3抑制鈦片表面ATCC35984生物膜形成（400×）

圖3 CLSM觀察 US聯(lián)合 MB在體內(nèi)增強(qiáng) HBD-3抑制鈦片表面ATCC43300生物膜形成（400×）

圖4 SEM觀察US聯(lián)合MB在體內(nèi)增強(qiáng)HBD-3抑制鈦片表面ATCC 35984生物膜形成（1000×）

圖5 SEM觀察US聯(lián)合MB在體內(nèi)增強(qiáng)HBD-3抑制鈦片表面ATCC 43300生物膜形成（1000×）

ATCC35984生物膜形成過程中， AD和 R基因表達(dá)水平是如圖6所示（彩圖見插頁）。 A和 D的表達(dá)水平在10MIC HBD-3聯(lián)合超聲或超聲+微泡處理組，與對照組、超聲處理組，超聲+微泡處理組和HBD-3單獨(dú)處理組相比顯著降低（＜0.05）。 R表達(dá)水平在10 MIC HBD-3聯(lián)合超聲或超聲+微泡處理組則明顯上調(diào)（＜0.05）。ATCC43300中A基因的表達(dá)水平在10 MIC HBD-3聯(lián)合超聲或超聲+微泡處理組，與對照組、超聲處理組、超聲+微泡處理組和 HBD-3單獨(dú)處理組相比，顯著降低（＜0.05）。此外，10MIC HBD-3聯(lián)合超聲+微泡處理組與10 MIC HBD-3+超聲處理組相比， AD和A的表達(dá)水平明顯降低，而R基因的表達(dá)明顯升高（＜0.05）。

圖6 Ica和MecA基因轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量PCR分析。結(jié)果表示為 ±s。*顯示兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異，＜0.05；#表示無顯著差異，＞0.05

3 討論

細(xì)菌生物膜的形成首先是細(xì)菌在宿主組織或內(nèi)植物表面粘附，其次是在粘附基礎(chǔ)上細(xì)菌增殖聚集形成生物膜。生物膜形成與基因位點(diǎn) ADBCR調(diào)控的胞間多糖黏附素密切相關(guān)，其中 A和 D的共表達(dá)是生物膜形成必需的[8]。此外， ADBC操縱子的表達(dá)受其上游抑制基因icaR的負(fù)調(diào)控[14]。本研究表明，10MIC HBD-3聯(lián)合超聲微泡處理組顯著下調(diào)鈦片表面生物膜內(nèi) AD表達(dá)并上調(diào) R的表達(dá)。這種抑制 AD轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致PIA產(chǎn)生的下調(diào)，從而降低了生物膜的形成。MRSA是甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）外源性獲得SCCmec而產(chǎn)生，它不僅存在于金葡菌中，也存在于其它凝固酶陽性和凝固酶陰性葡萄球菌中[7]。MecA基因編碼 PBP2，其可降低 -內(nèi)酰胺類抗生素對致病菌的抗菌活性，是MRSA及MRSE產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一[15]。研究表明，10MIC HBD-3聯(lián)合超聲微泡處理組可以明顯下調(diào)生物膜內(nèi)MecA基因的表達(dá)，這可能會增加MRSA和MRSE對苯唑西林敏感性。

超聲增加 HBD-3的抗菌作用機(jī)制較為復(fù)雜。一方面，超聲作為一種機(jī)械壓力波，可在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生高壓及高剪切力，增強(qiáng)細(xì)胞間的微對流，增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)HBD-3通過生物膜[16]。另一方面，增高輻照區(qū)域局部溫度，并在組織內(nèi)產(chǎn)生自由基，可能促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用超聲聯(lián)合靶向微泡破壞處理后，生物膜上出現(xiàn)的微孔較單純應(yīng)用超聲者顯著增大，這大大提高了HBD-3在膜內(nèi)和胞內(nèi)運(yùn)輸，或許是因?yàn)槲⑴荽蟠笤鰪?qiáng)了超聲的空化作用，有效降低了空化需要的閾值能量[3]。此外，多種因素影響超聲微泡增強(qiáng)HBD-3抑制生物膜內(nèi)的細(xì)菌。首先，超聲的參數(shù)，包括聲學(xué)強(qiáng)度、頻率、占空比和持續(xù)時間[18]。相關(guān)研究表明，低頻超聲（＜500KHZ）具有優(yōu)良的殺菌作用，對生物膜比高頻超聲聯(lián)合抗生素具有更好的抑菌效果。因?yàn)樗p低、不產(chǎn)生熱量、非侵入性且不易引起損傷[19]。第二，生物膜的成熟度也會影響抗菌作用?？股卮┩干锬さ哪芰﹄S生物膜成熟度的增加而明顯下降。本實(shí)驗(yàn)中，超聲微泡結(jié)合HBD-3明顯抑制已孵育24小時的MRSE和MRSA生物膜。因此，本研究對今后的臨床應(yīng)用有可行性意義。最后，超聲微泡介導(dǎo)對細(xì)菌生物膜的抗菌活性不僅與超聲參數(shù)條件有關(guān)，而且對HBD-3的濃度也有很高的要求[20]。因?yàn)镠BD-3在體內(nèi)會逐漸降解，高濃度HBD-3是聯(lián)合超聲微泡抑制體內(nèi)生物膜形成的必要條件。因此，在體內(nèi)優(yōu)化超聲微泡的參數(shù)條件并聯(lián)合有效濃度的 HBD-3是治療 MRSA和MRSE生物膜感染的基本條件。

本研究結(jié)果提供了令人鼓舞的證據(jù)，即超聲微泡可以提高HBD-3對抗生素耐藥菌生物膜形成的抗菌活性，并提供了一種對耐抗生素生物膜感染的非侵入性的和有針對性的方法。

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Enhancement of human -defensin 3 activity against antibiotic-resistant staphylococcus biofilms in mice model by ultrasound-targeted microbubble destruction

Objectives To investigate the effect of Human -defensin-3(HBD-3),an endogenous antimicrobial peptide, combined withultrasound(US)-targeted microbubble(MB）destruction(UTMD)onantibiotic-resistantStaphylococcus biofilms invivo.Methods Two biofilm-infectedtitaniumplateswereimplantedsubcutaneously bilateraltothespine.Biofilms of the 2 antibiotic-resistant Staphylococcus strains from the plates in mice were treated under 6 different conditions: (a)untreated control,(b)USonly,(c)US+MB,(d)10MICHBD-3,(e)10 MICHBD-3+USand(f)10MIC HBD-3+ US+MB.At 3 days after the surgery,the six treatments were completed,the mice were euthanized and the implants were takenout.Theamountofbacteriain the biofilms wereobservedbythe spread plate method,confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopes under different experiment conditions.Biofilm-associated and drug-resistant genes were quantitatively analyzed by real-time polymerase chain reaction, then statistical analysis was carried out.ResultsInthestudy,we demonstratedthatthepercentageoflivecells,andtheviablecounts of 2testedStaphylococcus recovered from the biofilms on the titanium surface in vivo were significantly decreased in the highest concentrations of HBD-3combinedwithUTMDcomparedwiththoseof anyother groups.Moremore,wefound thatUTMDcould enhance HBD-3 activity inhibiting the biofilm-associated genes expression of icaAD and the methicillin-resistance genes expressionofMecAbysimultaneously promoting the genesexpressionof icaR.ConclusionUTMDmayhavegreat potential for improving HBD-3 antibiotic activity against Staphylococcus biofilms infections in vivo.

Ultrasound;Microbubbles;Staphylococcus;Biofilm; -defensin

R378.1；R392.11

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.05.003

swgk2015-06-00115

朱晨（1979-）男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)鏡、創(chuàng)傷外科。

*[通訊作者]方詩元（1964-）男，碩士，主任醫(yī)師，教授。研究方向：創(chuàng)傷、脊柱外科。

2015-06-06）

國家自然科學(xué)基金（No:81401815，81301571，81271594）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨一科，安徽合肥230001