★ 元輝明 朱金華 馬廣強(qiáng)（江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南昌330004）

地黃內(nèi)生菌的分離鑒定及其抑菌活性測(cè)定

★ 元輝明 朱金華 馬廣強(qiáng)*（江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 南昌330004）

對(duì)河南焦作產(chǎn)鮮地黃的內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化，對(duì)其形態(tài)學(xué)、生化、16S rDNA序列進(jìn)行分析及抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，初步了解該菌的相關(guān)特性并為其資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。方法：對(duì)鮮地黃用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，用劃線法進(jìn)行分離與純化，然后用革蘭氏染色、生化管、16S rDNA序列分析鑒定、藥敏試紙抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)生菌及其抑菌性進(jìn)行鑒定。結(jié)果：篩選得到的鑒定菌在革蘭氏染色及鏡檢后鑒定顯示1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)菌均為梭狀細(xì)菌，4號(hào)為桿狀細(xì)菌；生化管實(shí)驗(yàn)的顏色變化顯示1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)菌為梭菌屬細(xì)菌，4號(hào)菌為土壤農(nóng)桿菌；16S rDNA的鑒定結(jié)果表明3號(hào)菌為蘇云金芽孢桿菌,3號(hào)菌對(duì)三種病原微生物的抑菌作用不明顯。結(jié)論：地黃中分離純化得到的3號(hào)菌的抑菌活性不顯著。

內(nèi)生菌；分離純化；革蘭氏染色鑒定；生化管鑒定；PCR

內(nèi)生菌是指一類(lèi)在其部分或其全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。關(guān)于內(nèi)生菌的藥用活性成分，我國(guó)學(xué)者對(duì)一些傳統(tǒng)藥用植物的內(nèi)生菌進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了許多藥用活性成分,有些內(nèi)生菌在非藥用植物體內(nèi)也可以產(chǎn)生一些對(duì)病原菌有拮抗作用的活性成分。通過(guò)對(duì)鮮地黃（Rehmannia glutinosa）的內(nèi)生菌的分離純化，研究某類(lèi)內(nèi)生菌的抑菌性，從而了解該類(lèi)菌與地黃的互惠共生關(guān)系，對(duì)該類(lèi)菌進(jìn)行分離與純化，其代謝產(chǎn)物的藥性研究對(duì)地黃的產(chǎn)量具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料:

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 河南焦作鮮地黃

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 營(yíng)養(yǎng)瓊脂；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)肉湯；生理鹽水；結(jié)晶紫溶液；盧戈氏碘液；95%的酒精溶液；復(fù)紅溶液；腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管；3種病原菌（大腸桿菌、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌）；瓊脂糖；TAE；EB替代染料；細(xì)菌基因組提取試劑盒；溶菌酶；m ix；上、下游引物；M arker等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）,高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申有限公司）,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）,凝膠成像系統(tǒng)（Fluorchem M）等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制與滅菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基：稱(chēng)取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基粉末6.2g用蒸餾水配制成200m l培養(yǎng)液；高壓蒸汽滅菌后分裝到培養(yǎng)皿中。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂：稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉末9.0g用蒸餾水配制成200m l；培養(yǎng)液高壓蒸汽滅菌后分裝到培養(yǎng)皿中。

營(yíng)養(yǎng)肉湯：稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯粉末3.6g用蒸餾水配制成200m l培養(yǎng)液。

生理鹽水：將配置好的0.9%的生理鹽水分裝成10支（9m L/支）。

1.2.2 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng)與分離純化 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng)：取一塊河南焦作原產(chǎn)地地黃，先用蒸餾水水洗干凈，然后去超凈工作臺(tái)操作。先點(diǎn)燃酒精燈，然后將刀片在酒精燈火焰上過(guò)幾下，確保刀片無(wú)菌，然后用刀片將地黃表皮切除，將已去表皮的地黃切取四小塊，將這四個(gè)地黃切塊置于盛有75%的酒精的燒杯中，兩分鐘后取出，用三蒸水沖洗四次后，置于干凈燒杯中。取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基各一個(gè)，用鑷子在酒精燈上烤幾下，然后各自?shī)A取兩塊地黃切片均勻放于兩個(gè)培養(yǎng)基中。最后將兩個(gè)培養(yǎng)基放于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

內(nèi)生菌的分離與純化：取有特殊形態(tài)的菌落，用三線法劃線分離細(xì)菌后于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h以獲得單菌落。

1.2.3 地黃內(nèi)生菌的液體培養(yǎng) 將純化的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)內(nèi)生菌接種至裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中進(jìn)行液體培養(yǎng)，放于37℃液體搖床中進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。

1.2.4 地黃內(nèi)生菌的平板涂布計(jì)數(shù) 地黃切片：取一塊地黃，先用蒸餾水沖洗干凈，在無(wú)菌操作條件下，用小刀將表皮切除，然后切成小片，再于電子天平上稱(chēng)取1克地黃切片。將此切片于75%的酒精中浸泡一分鐘后，再用三蒸水沖洗四次，沖洗干凈后。再在無(wú)菌條件下，把此切片放于已滅菌的研缽中，用移液槍向研缽中加入5mL生理鹽水，然后進(jìn)行研磨，再用移液槍吸取2mL于一滅菌的試管中，并用記號(hào)筆標(biāo)記為0，即為原液。另外再用移液槍吸取1mL原液備用，用于原液DNA提取，用于后面的實(shí)驗(yàn)，并標(biāo)記為原液--DNA。

原液梯度稀釋?zhuān)簩⑷?mL的三蒸水排列好，按10-1、10-2和10-3依次編號(hào)。在無(wú)菌操作條件下，用1mL無(wú)菌移液槍吸取1mL原液于裝有9mL三蒸水并標(biāo)有10-1的試管中，將移液槍吹洗三次，搖勻即為10-1濃度菌液。1mL移液槍更換槍頭后，用同樣方法，制成10-2和10-3濃度的菌液。

平板涂布與培養(yǎng)：將已經(jīng)準(zhǔn)備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基若干個(gè)放于超凈工作臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，用1mL移液槍在已剩有1mL原液的試管中吸盡1mL原液，然后在酒精燈旁操作，將此1mL原液打入一個(gè)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中，再用已滅菌了的涂布棒桿勻菌液，最后用記號(hào)筆在此培養(yǎng)基平板上標(biāo)記1號(hào)。用同樣方法將10-1、10-2和10-3梯度的菌液吸取1mL后涂布于培養(yǎng)基上并標(biāo)記為2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)。最后將這四個(gè)平板放到30℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。

1.2.5 革蘭氏染色法 革蘭氏染色鑒定細(xì)菌的顯微形態(tài)。

1.2.6 生化微量鑒定管鑒定 常用的生化鑒定管對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定。

1.2.7 PCR實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 試劑盒方法提取細(xì)菌總D N A。

1.2.7.2 PCR反應(yīng) 用取菌DNA 4μL，再加入10μL mix和上、下引物各3μL，制成20μL的PCR反應(yīng)體系。然后將裝有20μL的PCR反應(yīng)體系的離心管放進(jìn)PCR儀。在PCR儀設(shè)置程序，一個(gè)循環(huán)：95℃（30 s），55℃（30 s），72℃（1.5 min）。如此循環(huán)30次。

1.2.7.3 PCR產(chǎn)物電泳鑒定 配制成1%的瓊脂糖溶液；每孔加入2μL PCR產(chǎn)物；80 V電泳25min，用紫外透視儀觀察擴(kuò)增條帶，與Maker長(zhǎng)度對(duì)照，若條帶與引物設(shè)計(jì)時(shí)的擴(kuò)增條帶相符，PCR產(chǎn)物則送往生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.8 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 病原菌平板劃線涂布 大腸桿菌、結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌涂布整個(gè)平板后倒置平板。

1.2.8.2 藥敏試紙 取浸泡內(nèi)生菌細(xì)菌培養(yǎng)液的藥敏紙片均勻粘貼到涂布病原菌的固體培養(yǎng)基上，37度，培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

圖1 地黃內(nèi)生菌的分離純化。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

表1 生化微量鑒定管鑒定結(jié)果表

2.1 地黃內(nèi)生菌的培養(yǎng) 共分離到四株懷地黃植物內(nèi)生菌，見(jiàn)如圖1。

2.2 革蘭氏染色及顯微觀察結(jié)果 見(jiàn)圖2，其中1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，4號(hào)菌為革蘭氏陰性菌。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)菌呈梭狀，有鞭毛，芽孢橢圓或球形孢囊膨大；4號(hào)菌呈桿狀，有鞭毛，無(wú)莢膜。

2.3 生化微量鑒定管鑒定 見(jiàn)表1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出的是四種菌生化反應(yīng)各異，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)知道1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)菌是梭菌屬，且3號(hào)菌為蘇云金芽孢桿菌，4號(hào)菌為枯草芽孢桿菌。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4 16S rDNA產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析和測(cè)序結(jié)果的序列對(duì)比分析。

2.4.1 16S rDNA產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析 見(jiàn)圖3。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以知道從3號(hào)菌的D N A與從地黃切片制成的原液中的D N A擴(kuò)增的目的基因片段大小相似。（其中marker為5000bp）

2.4.2 測(cè)序結(jié)果的序列對(duì)比分析 經(jīng)生物公司測(cè)序后獲得的3號(hào)菌的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段，在進(jìn)入N C B I公司的軟件序列對(duì)比分析獲得了進(jìn)化樹(shù)信息，見(jiàn)圖4。

圖4 進(jìn)化樹(shù)分析3號(hào)菌16S rDNA序列

經(jīng)進(jìn)化樹(shù)圖分析后可知3號(hào)菌為梭菌屬且為蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）。2.5對(duì)病原細(xì)菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2。結(jié)果可以知3號(hào)菌對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌作用較明顯，較可能會(huì)分泌一些抗菌物質(zhì)以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

表2 3號(hào)菌對(duì)病原菌抑菌效果

3 討論

國(guó)內(nèi)外有很多應(yīng)用經(jīng)典方法如細(xì)菌的菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化特性、代謝產(chǎn)物等對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定的研究，但這些傳統(tǒng)的方法鑒定微生物耗時(shí)耗力，而且培養(yǎng)條件的改變可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果發(fā)生變化，即鑒定結(jié)果很不穩(wěn)定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括熒光定量P C R技術(shù)在內(nèi)的一批新技術(shù)的應(yīng)用，使得微生物學(xué)的研究擺脫了傳統(tǒng)依靠純培養(yǎng)分離鑒定的束縛，使快速、全面、準(zhǔn)確地反映微生物多樣性成為可能。然而雖然現(xiàn)代技術(shù)更快、更好、更精確，但也不保證在鑒定過(guò)程中失誤。因此在本次實(shí)驗(yàn)研究中，我采用了傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合的鑒定方法，以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確與可靠。

目前，對(duì)許多內(nèi)生菌產(chǎn)的活性物質(zhì)研究不完全清楚，難以得到較為純凈的有效成份。這也影響了內(nèi)生茵的實(shí)際應(yīng)用。但從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度看，內(nèi)生菌的研究會(huì)給內(nèi)生菌的應(yīng)用帶來(lái)新的契機(jī)，必將給人類(lèi)的生活帶來(lái)更大的利益，具有重要和廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

［1］Li Wan-Kui，HU Zhi-Bi．Endophytes and Natural Medicines[M]．Institute of Materia Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，2012.

［2］WU L，HAN T，LIW，et a1．Geographic and tissue influences on endophytic fungal communities of Taxus chinensis var．mairei in China[J]．CurrentMi-crobiology，2013，66（1）：40-48．

Isolation,Identification and Antibacterial Activities of Endophytes in Fresh Rehmannia

YUAN Hui-m ing,ZHU Jin-hua,MA Guang-qiang
JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China.

Objective:Endophytes of henan jiaozuo fresh Rehmannia get endophytes separation,purification,and then on themorphology,biochemistry,16S rDNA identification and the determination of antibacterial activity,preliminary understanding the characteristics of the bacteria and provide data for the development and utilization of its resources.Methods:the fresh Rehmannia nourished with nutrient AGAR culturemedium and rosy sodium,by exploringmethod for separation and purification,and then using gram staining, biochemical tube,PCR and drug susceptibility test paper bacteriostatic experiment of endophytes and their antibacterial sex identification.Results:the identification of bacteria in screening for gram staining and microscopy after identification showed no.1,2 and 3 were fusiform bacteria,4 for rod-shaped bacteria;Biochemical tube experiments showed the color change of the no.1,2 and 3 bacteria for Clostridium bacteria,4 bacteria for soil Agrobacterium;16S rDNA identification results showed that the 3 bacteria for bacteria and fusobacterium thuringiensis bacillus;And 3 isolates on the bacteriostatic action of three kinds of pathogenicmicroorganismswere not obvious.Conclusion:No.3 bacteria's antibacterial activity are not significant.

endophytic bacteria;Separation and purification;Gram staining appraisal;Biochemical identification;PCR

R285.5

A

2014-05-30）編輯：曾文雪

*通信作者：馬廣強(qiáng)（1977-），男，副教授。研究方向：微生物與免疫學(xué)。T el:18770050616,E-m a il:m a g u a n g q i a n g@163.co m。