江必武， 賈學(xué)平， 吳玉芳， 李軼西， 胡 偉， 劉 嵩， 時昭紅

臍血干細胞移植治療對失代償期肝硬化患者細胞因子水平的影響及其臨床意義＊

江必武， 賈學(xué)平， 吳玉芳， 李軼西， 胡 偉， 劉 嵩， 時昭紅△

武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022

目的 探討失代償期肝硬化患者經(jīng)臍血干細胞移植治療后血清中細胞因子水平的變化及其臨床意義。方法選取50例失代償期肝硬化患者，經(jīng)肝動脈灌注進行臍血干細胞移植治療，采用ELISA方法檢測術(shù)前及術(shù)后第8、16、24周血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、成纖維細胞生長因子-β（FGF-β）水平及肝纖維化指標(biāo)的變化。結(jié)果 患者在臍血干細胞移植治療后第8周就出現(xiàn)肝功能好轉(zhuǎn)并持續(xù)改善，第16、24周較術(shù)前明顯改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；治療后第16、24周患者血清中TNF-α、IL-6、FGF-β水平均較術(shù)前明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；術(shù)后第24周肝纖維化指標(biāo)亦有明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論 臍血干細胞移植治療能改善失代償期肝硬化患者的肝功能及降低血清TNF-α、IL-6、FGF-β等細胞因子水平，有望作為一種新的治療失代償期肝硬化的方法而得到推廣。

臍血干細胞移植； 失代償期肝硬化； 腫瘤壞死因子-α； 白細胞介素-6； 成纖維細胞生長因子-β； 肝纖維化指標(biāo)

肝硬化是各型慢性肝病漸進演化的終末表現(xiàn)，肝功能損害、凝血功能障礙、腹腔積液、肝性腦病等在失代償期時表現(xiàn)得更為明顯，傳統(tǒng)治療以護肝、降酶、利尿、補充白蛋白為主，臨床療效欠佳且難以持久。近年來，隨著對骨髓（臍血）間充質(zhì)干細胞移植術(shù)的不斷深入研究和推廣，通過臍血干細胞移植術(shù)治療失代償期肝硬化已被臨床采用，其能有效改善肝硬化患者的生活質(zhì)量及凝血功能、肝功能［1］。為進一步探討細胞因子在臍血干細胞對肝細胞修復(fù)中發(fā)揮的作用及機制，本文分析了我科50例采用臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化患者治療前后的血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、成纖維細胞生長因子-β（FGF-β）水平變化及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年11月～2013年10月收治的50例失代償期肝硬化患者，入院后均給予護肝、降酶及支持對癥治療，必要時利尿、補充白蛋白等，待病情好轉(zhuǎn)后擇期行臍血干細胞移植治療。其中男28例，女22例，年齡最小者33歲，最大者81歲，平均年齡（60.06±12.13）歲。50例患者中乙型肝炎后肝硬化26例、丙型肝炎后肝硬化3例、酒精性肝硬化8例、血吸蟲性肝硬化7例、自身免疫性肝硬化3例、隱原性肝硬化3例。按Child-Pugh分級:A級11例，B級29例，C級10例。50例患者治療前均行上腹部彩超或腹部CT檢查明確診斷為肝硬化，并排除細菌性腹膜炎及病毒復(fù)制期（病毒載量＞5.0× 102copies／mL）。我院開展臍血干細胞移植治療已通過上級衛(wèi)生行政主管部門備案，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并且在患者知情同意下進行。

1.2 臍血干細胞的制備與移植

嚴格按照臍血采集標(biāo)準(zhǔn)和要求進行操作，選取健康產(chǎn)婦，在產(chǎn)前做好各項酶學(xué)及病毒學(xué)排查。于新生兒娩出后立即斷臍并行包扎處理，使用采血袋針于胎盤側(cè)刺入臍靜脈留取臍血約150～200mL。采用寧夏中聯(lián)達生物有限公司生產(chǎn)的臍帶血細胞處理試劑盒進行分離、純化，并對干細胞計數(shù)。按臨床需求將細胞置于5mL細胞轉(zhuǎn)移管中，術(shù)前2h內(nèi)置于冰桶送臨床使用。

1.3 移植途徑及方法

常規(guī)準(zhǔn)備后，以2%利多卡因局麻，采用Seldinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動脈，在數(shù)字減影血管造影（DSA）設(shè)備的透視下引入5FYashiro導(dǎo)管，將導(dǎo)絲沿肝總動脈、肝固有動脈送至肝動脈遠端后固定，在導(dǎo)絲支撐下，將導(dǎo)管超選擇性送至肝固有動脈，固定導(dǎo)管，拔出導(dǎo)絲。經(jīng)導(dǎo)管再次注入非離子型造影劑攝影，排除肝內(nèi)腫瘤性病變，再次確認導(dǎo)管頭端位置超過胃十二指腸動脈，停止DSA透視。囑患者平靜呼吸，固定好導(dǎo)管位置，用鹽水沖洗導(dǎo)管內(nèi)殘留造影劑，將分離好的臍血干細胞懸液經(jīng)導(dǎo)管緩慢勻速注入肝內(nèi)，并注入適量生理鹽水沖洗導(dǎo)管殘留液。術(shù)畢拔管，動脈壓迫器加壓包扎穿刺傷口8h，右下肢伸直平臥8h。術(shù)后給予常規(guī)護肝等治療3d。

1.4 觀察指標(biāo)

治療前及移植治療后8、16、24周分別檢查血常規(guī)、凝血全套、肝功能、腎功能、細胞因子（TNF-α、IL-6、FGF-β）及肝纖維化全套（HA、LN、ⅢNP、ⅣCol）等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以ˉx±s表示，治療前后數(shù)據(jù)分析采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能的改善

臍血干細胞移植后第8周可見肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）較移植前持續(xù)向好，血清白蛋白（ALB）水平呈逐步升高趨勢，在術(shù)后第16周、24周較術(shù)前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。移植術(shù)后患者均未輸注血漿及白蛋白，31例腹腔積液患者中14例腹水明顯減少，17例腹水基本消退。

2.2 血清細胞因子TNF-α、IL-6、FGF-β水平降低

臍血干細胞治療后第8周即出現(xiàn)血清TNF-α、IL-6、FGF-β水平下降，到術(shù)后第16周、24周進一步下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 肝纖維化指標(biāo)改善

自術(shù)后第8周，肝纖維化指標(biāo)變化出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，隨著隨訪時間的延長呈持續(xù)改善，術(shù)后第24周肝纖維化指標(biāo)顯著改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表1 臍血干細胞移植治療后肝功能指標(biāo)的變化（ˉx±s）Table1 Changes of liver function indexes after umbilical cord blood stem cell transplantation（ˉx±s）

表2 臍血干細胞移植治療后細胞因子水平的變化（ˉx±s）Table2 Changes of cytokines after umbilical cord blood stem cell transplantation（ˉx±s）

表3 臍血干細胞移植治療后肝纖維化指標(biāo)的變化（ˉx±s）Table3 Changes of liver fibrosis indexes after umbilical cord blood stem cell transplantation（ˉx±s）

3 討論

肝硬化的病理改變表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(zhì)（ECM）合成增多，降解相對不足，致過多沉積在肝內(nèi)引起肝纖維化，若進一步發(fā)展引起肝小葉改建、假小葉和結(jié)節(jié)形成，則進入肝硬化。其中肝星狀細胞（HSC）被激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，合成大量的膠原和蛋白多糖等ECM是肝纖維化及肝硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。在這一過程中，細胞-細胞因子-基質(zhì)之間相互作用，構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，涉及多種遞質(zhì)間的相互作用，一系列生長因子、細胞因子、趨化因子等參與其中，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用［2－3］。適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)能保護肝細胞，過度炎性反應(yīng)與炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，而抗炎性因子的反應(yīng)一旦過度，則容易誘發(fā)代償性抗炎性反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致免疫功能低下，加重肝細胞的壞死和變性，促進肝纖維化和肝硬化的形成。這在我們前期研究重型肝炎并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎患者血清和腹水中細胞因子水平的變化中也得到了驗證［4］，因而，糾正細胞因子失衡，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)強度對維持患者內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要意義。

在慢性肝病及肝硬化失代償期患者中，由于腸道黏膜的結(jié)構(gòu)改變，如緊密連接丟失、細胞間隙擴大、黏膜免疫缺陷等導(dǎo)致了黏膜屏障破壞而發(fā)生細菌移位。血循環(huán)和／或腹水中內(nèi)毒素水平明顯升高，使肝組織不斷受病毒和（或）內(nèi)毒素刺激，肝內(nèi)單核巨噬細胞系統(tǒng)和腹腔中的巨噬細胞不斷產(chǎn)生TNF-α，TNF-α作為主要的炎癥始發(fā)細胞因子，作用于血管內(nèi)皮系統(tǒng)和免疫炎性細胞，觸發(fā)了炎癥級聯(lián)反應(yīng)。內(nèi)毒素和TNF-α、IL-1等因素能刺激大多數(shù)淋巴細胞及單核細胞產(chǎn)生IL-6，其在細胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Lemmers等［5］發(fā)現(xiàn)IL-6作為肝細胞刺激因子，可直接刺激肝細胞增生、分泌膠原，刺激儲能細胞增生并合成膠原、層粘連蛋白和蛋白多糖，也可促進細胞因子及免疫球蛋白的表達，抑制膠原酶活性，減少膠原蛋白降解，使肝臟膠原沉積，促進肝纖維化形成。FGF-β促進ECM的合成與沉積作用主要是通過促進肝臟間質(zhì)細胞的激活、增殖作用和增加間質(zhì)細胞對ECM成分的合成實現(xiàn)的。

近年來，臍血干細胞移植術(shù)治療失代償期肝硬化已被臨床采用，其作用機制可能為:①直接分化為肝細胞，補充肝細胞數(shù)量，改善肝功能，從而防止肝纖維化的進一步發(fā)展［6］；②分泌多種生長因子和細胞因子如IL-10等，通過復(fù)雜的旁分泌等方式，改變植入部位的微環(huán)境，減輕炎癥、啟動肝細胞的內(nèi)源性再生，從而恢復(fù)肝功能［7］；③通過抑制星狀細胞活化，促進星狀細胞凋亡，減少ECM的生成，促進其降解，從而減輕肝纖維化程度［8］。朱永朝等［9］對人胎盤母體和胎兒來源間充質(zhì)干細胞IL-6、IL-8、IL-10和HGF表達水平的比較研究提示，人胎盤胎兒來源間充質(zhì)干細胞在免疫抑制和組織修復(fù)中可能更具臨床應(yīng)用潛力。

本研究結(jié)果顯示，在肝硬化失代償期患者治療前血清TNF-α、IL-6、FGF-β明顯升高，表明患者血清中細胞因子系統(tǒng)存在分泌調(diào)節(jié)紊亂，免疫功能失調(diào)，使肝細胞受損。經(jīng)臍血干細胞移植治療后，患者肝功能較移植前持續(xù)向好，其中血清白蛋白水平呈逐步升高趨勢，與術(shù)前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?；颊哐錞NF-α、IL-6、FGF-β水平呈下降趨勢，至術(shù)后第16、24周血清TNF-α、IL-6、FGF-β水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），同時在移植治療后第24周，我們檢測到患者血清肝纖維化指標(biāo)亦出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）。近年來，隨著對骨髓（臍血）間充質(zhì)干細胞移植術(shù)的不斷深入研究和推廣，臨床上通過處理分娩廢棄的臍血可獲得大量的間充質(zhì)干細胞，具有取材方便，來源廣，數(shù)量充足，干／祖細胞更原始，增殖能力強，沒有致瘤性，免疫原性較弱，移植物抗宿主病發(fā)生率較低，不違背醫(yī)學(xué)倫理道德等優(yōu)點。我們在以后的工作中將進一步積累臍血干細胞移植治療的經(jīng)驗，也希望臍血干細胞移植作為失代償期肝硬化患者的一種新的治療方法得到推廣

［1］ 江必武，賈學(xué)平，時昭紅，等.臍血干細胞移植治療失代償期肝硬化后血常規(guī)及凝血功能的臨床觀察［J］.血栓與止血學(xué)，2014，20（4）:173-175.

［2］ 吳玉卓，張玉婷，毛小榮，等.EGF和HGF體外誘導(dǎo)肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞分化的實驗研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，30（16）:1541-1544.

［3］ 陳黎明，徐若男，呂颯，等.臍帶間充質(zhì)干細胞對肝星狀細胞活化、凋亡的調(diào)控作用研究［J］.軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39（1）:11-14.

［4］ 江必武，田德英，黃加權(quán)，等.重型肝炎并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎患者血清和腹水中TNF-α、IL-6和IL-8水平的檢測及意義［J］.同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，30（1）:66-68.

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［9］ 朱永朝，王立斌，馬海濱，等.人胎盤來源的兩種間充質(zhì)干細胞IL6、IL8、IL10和HGF表達水平的比較研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（10）:5-9.

（2014-12-01 收稿）

Changes of Cytokines in Patients with Decompensated Liver Cirrhosis after Umbilical Cord Blood Stem Cell Transplantation and the Clinical Significance

Jiang Biwu，Jia Xueping，Wu Yufang et al
Department of Gastroenterology，Wuhan Integrated Chinese and Western Medicine Hospital，Wuhan 430022，China

Objective To investigate the changes of cytokines in the serum of patients with decompensated liver cirrhosis after umbilical cord blood stem cell transplantation and their clinical significance.Methods A total of 50patients with decompensated liver cirrhosis were recruited in the study and treated with umbilical cord blood stem cell transplantation by hepatic arterial infusion.The levels of TNF-α，IL-6，F(xiàn)GF-βand the liver fibrosis indexes in the serum were detected by means of ELISA before and 8，16，24weeks after transplantation and the changes of these indexes were observed.Results The liver function was improved 8weeks after umbilical cord blood stem cell transplantation and was continuously improved.There was significant difference in the liver function indexes between before and 16，24weeks after transplantation（P＜0.05）.The levels of TNF-α，IL-6，and FGF-βwere conspicuously decreased in the serum of patients at 16and 24weeks with significant difference observed when compared with those before transplantation（P＜0.05）.Moreover，the liver fibrosis indexes were also improved significantly at 24weeks（P＜0.05）.Conclusion Umbilical cord blood stem cell transplantation can improve the liver function and decrease the levels of TNF-α，IL-6and FGF-βin patients with decompensated liver cirrhosis and it is expected to become an alternative treatment for decompensated liver cirrhosis and worth popularization.

umbilical cord blood stem cell transplantation； decompensated liver cirrhosis； tumor necrosis factor-α；interleukin-6； basic fibroblast growth factor-β； liver fibrosis indexes

R575.2

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.011

＊湖北省自然科學(xué)基金資助項目（No.2013CFC115）

江必武，男，1969年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:253918565＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:306526683＠qq.com