朱義保，謝彤，楊亮亮，萬磊

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006)

大量的流行病學和分子生物學研究資料表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染與宮頸癌及癌前病變關(guān)系密切，是宮頸癌的主要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)在HPV致癌過程中，常發(fā)生HPV E2基因的缺陷，E2完整性遭到破壞，引起致癌性基因E6、E7過量表達，高表達的E6和E7通過與細胞抑癌基因P53和Rb蛋白產(chǎn)物作用并使之失活，導(dǎo)致細胞無限制生長進而引起癌變[1]。因此在本課題中，我們以感染HPFV16的不同宮頸病變?yōu)闃吮?，提取DNA，用定量PCR的方法分析HPV16 E2/E7的比值，描述病毒的存在狀態(tài)，探討病毒整合與宮頸病變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇來我院診治的住院患者，用塑料毛刷取樣器采集宮頸脫落細胞，根據(jù)患者的病理結(jié)果和HPV16感染情況，選取慢性宮頸炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ 23例，宮頸癌28例。這些患者無子宮切除術(shù)史、無急性生殖道炎癥、無盆腔放射治療史、無細胞學檢查異?；?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變史、非月經(jīng)期、非孕期、患者檢查前24h未進行性生活、藥水沖洗及陰道用藥等。

1.2 主要試劑及儀器 HPV16質(zhì)粒(P1203)由美國Addgene公司惠贈。DNA提起試劑盒、質(zhì)粒提取試劑 盒 、PCR 試 劑 、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑等購自為北京天為時代公司，ABI 7300實時熒光定量基因擴增儀為美國Applied Biosystems產(chǎn)品。

1.3 DNA提取 從宮頸管采樣，樣品分2份，一份做人乳頭瘤病毒分型檢測，另一份備用，對于人乳頭瘤病毒分型檢測HPV16陽性的標本，取相應(yīng)的備用樣品提取DNA，相關(guān)步驟參見北京天為DNA提取試劑盒。為確認樣品HPV16的感染，對提取后的DNA進行HPV16 E7基因擴增，通過凝膠電泳確認樣品存在HPV16感染。

1.4 E2和E7基因定量PCR擴增條件 引物由華大基因公司合成，HPV16 E2上游引物 5’-TGCGCCTAGAATGTGCTATTTA-3’，下游引物 5’-TCTTTGATACAGCCAGTGTTGG-3’，擴增片度長93bp；HPV16 E7 上游引物 5’-TGCAACCAGAGACAACTGAT-3’，下游引物 5’-TGTCTACGTGTGTGCTTTGT-3’，擴增片段長183bp?？偡磻?yīng)體系為20μl， 包括 2μl DNA 模板，0.5μl正反引物，10μl SuperReal PreMix Plus， 加 ddH2O 至 20μl， 定量PCR擴增條件為95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s，57℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，40次循環(huán)擴增反應(yīng)結(jié)束。

1.5 標準曲線的繪制、游離型和混合型HPV16的界 定 及 標 本 測 定 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16質(zhì)粒為模板，每個濃度檢測6次，對E2和E7基因進行PCR擴增，取不同批次不同濃度下E2和E7基因的CT均數(shù)，構(gòu)建標準曲線，并取同批次不同濃度下E2/E7比值95%參考值的下限，作為區(qū)分游離型和混合型HPV16的臨界值；樣品DNA根據(jù)E2和E7基因的標準曲線，計算E2和E7基因的量，得出各自E2/E7的比值。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SSPS17.0軟件 應(yīng)用t檢驗、卡方分析對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計學分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 E2和E7基因標準曲線的制定 為保證數(shù)據(jù)的可靠性，我們重復(fù)了 6次以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl的HPV16質(zhì)粒為標準濃度的檢測，計算不同批次不同濃度下E2和E7基因CT值的平均值、標準差及變異系數(shù)，在基礎(chǔ)上以E2和E7 CT值的平均值構(gòu)建標準曲線。結(jié)果如圖1所示，E2和E7基因擴增曲線良好，實驗所得標準曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.97，表明Ct值與起始拷貝數(shù)的對數(shù)值線性關(guān)系良好，6次實驗結(jié)果的變異系數(shù)均數(shù)小于4%，表明實驗重復(fù)性好，實驗結(jié)果可靠。

圖1 E2和E7基因的標準曲線

2.2 HPV16存在狀態(tài)的認定 在HPV16整合過程中，E2基因常缺失，理論上可認定E2/E7＝1是游離型，0＜E2/E7＜1 為游離和整合的混合型，E2/E7＝0為整合型，但在E2和E7基因的實際擴增中，可存在一定隨機誤差，游離狀態(tài)下E2/E7比值會在1上 下 浮 動[6,7]， 因 此 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16質(zhì)粒為模板，每個濃度檢測6次，得到了30個E2/E7比值，所得值介于0.76～1.24之間，95%參考值范圍為 1.04±0.27，即 0.77～1.31，因此本研究所采用以下標準來判斷HPV16的存在狀態(tài)，認為：E2/E7=0為整合型，E2/E7≥0.77為游離型，0

2.3 HPV16存在狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系 根據(jù)上述HPV16認定存在狀態(tài)的標準，發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌HPV16的整合率分別為 4.00%、9.09%、13.04%、10.71%， 統(tǒng)計顯示HPV16整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌中分布的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.55)；因混合型HPV16中也有病毒的整合，因此把混合型與整合型HPV16合并，得出HPV16總整合率分別為 48.00%、59.09%、65.22%、75.00%， 分析顯示HPV16總整合率在各宮頸病變程度間亦不顯著(P=0.23)，HPV16總整合率在宮頸病變的分布亦無差異。見圖2。

圖2 不同宮頸病變的HPV16狀態(tài)分布

3 討論

人乳頭瘤病毒的感染是宮頸癌發(fā)生的致病因素，目前對HPV類型及數(shù)量的檢測有重要的應(yīng)用價值，但其對預(yù)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后作用不大[2]。高危型HPV的持續(xù)感染，病毒DNA會整合入宿主細胞染色體脆性部位，導(dǎo)致病毒基因表達的失調(diào)、宿主基因的不穩(wěn)定甚至細胞癌基因的激活[3]，因此研究HPV病毒整合對探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制，及預(yù)測宮頸病變的轉(zhuǎn)歸有重要意義。在本課題中，我們以感染HPFV16的不同宮頸病變?yōu)閷ο?，用定量PCR方法分析HPV16整合情況，描述病毒的存在狀態(tài)，探討HPV16病毒整合與不同宮頸病變的關(guān)系。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)慢性宮頸炎/CINⅠ的HPV16整合率為4.00%，CINⅡ為9.09%，CINⅢ為13.04%，宮頸癌為10.71%%，HPV16整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布沒有差別，沒有統(tǒng)計學意義。因混合型HPV16也存在病毒整合，把整合型和混合型HPV16合并，合并后的的HPV16總整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌分別為48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，統(tǒng)計顯示HPV16總整合率在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布中同樣沒有差別，無統(tǒng)計學意義。我們的結(jié)論同國內(nèi)報道相反[4-6]，同國外報道一致[7，8]，病毒整合率雖隨宮頸病變級別升高而增加，但病毒整合與宮頸病變無關(guān)。因此我們認為，HPV16病毒整合和宮頸病變關(guān)系不明顯，在宮頸病變早期HPV16就有48.00%的整合率，表明宮頸病變早期就有HPV16整合發(fā)生，病毒整合是宮頸病變的早期事件[9]。

近年來腫瘤形成學認為，腫瘤的發(fā)生是由腫瘤干細胞引起的。20世紀歐洲的病理學家就觀察到腫瘤是由處于各個分化階段的腫瘤細胞組成的一個非均勻混合物，類似于一個正常的器官。研究者們此后在一系列的實驗中發(fā)現(xiàn)，只有小部分腫瘤細胞具有自我更新能力，其他腫瘤細胞不具有這種能力，如白血病、骨髓瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌等小部分腫瘤細胞能克隆形成集落，僅有這小部分腫瘤細胞在適當?shù)耐饨缧盘柎碳は履苄纬赡[瘤[10-12]，因而提出了腫瘤干細胞的學說?，F(xiàn)已有學者從宮頸癌組織和宮頸癌細胞系中提取到了的宮頸癌干細胞[13,14]。

目前研究認為宮頸癌干細胞傾向于來源能向柱狀上皮或鱗狀上皮分化的儲備細胞，如在同一張切片上，或同一宮頸組織的連續(xù)切片上，能觀察到儲備細胞增殖、增生、化生、非典型增生直至癌變的各個階段的連續(xù)性和過渡性的組織學圖像，提取到的宮頸癌干細胞也表達儲備細胞標志角蛋白CK17等[13,15,16]。因此，結(jié)合腫瘤干細胞理論和實驗數(shù)據(jù)，我們認為只有發(fā)生了HPV整合的儲備細胞才有可能發(fā)生宮頸病變。在宮頸病變的標本中，樣品可能含有儲備細胞，但也有鱗狀上皮細胞或柱狀上皮細胞，特別是早期宮頸病變樣本。實驗數(shù)據(jù)表明早期宮頸病變即有高頻率的病毒整合，提示除了儲備細胞與HPV16發(fā)生整合外，鱗狀上皮細胞或柱狀上皮細胞也可能會與HPV16發(fā)生整合，因為存在上皮細胞的整合干擾，這可能是HPV16整合與宮頸病變關(guān)系不明顯的原因。而且，這種現(xiàn)象也提示，分化成熟的上皮細胞雖發(fā)生了病毒整合，也難以獲得惡性表型，只有未分化的發(fā)生病毒整合的儲備細胞才有可能發(fā)生惡變，進一步表明了宮頸癌干細胞來源的問題。

綜上所述，我們認為鱗狀上皮細胞或柱狀上皮細胞也能與HPV16發(fā)生整合，病毒整合是宮頸病變的早期事件，HPV16整合與宮頸病變程度沒有明顯的關(guān)系。

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