張慧慧，熊國(guó)亮

(江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌330006)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人民健康的呼吸道傳染病。中國(guó)是全球結(jié)核病高發(fā)的國(guó)家之一。根據(jù)2010年全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，我國(guó)全人群活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為459/10萬(wàn)，其中傳染性肺結(jié)核患病率為66/10萬(wàn)[1]。實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病患者早期治療的基礎(chǔ)是早期快速診斷，這也是預(yù)防和控制結(jié)核病傳播的重要手段。結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)是結(jié)核病診斷的重要依據(jù)之一，目前臨床上常用方法有：直接涂片抗酸染色法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，但其敏感度低，特異度也較差，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌，不能辨別是否活菌；羅氏培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但羅氏培養(yǎng)和菌種鑒定需要6~8周，不能達(dá)到結(jié)核病早期診斷的要求[2-4]。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法為擴(kuò)增結(jié)核分桿菌特異性的DNA片段并進(jìn)行探針雜交或進(jìn)行熒光定量檢測(cè)[5-8]。本研究采用RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)(simultaneous amplification and testing,SAT)新技術(shù)檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，并探討該枝術(shù)對(duì)肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2014年6月至10月我院結(jié)核科住院137例肺結(jié)核患者，其中男94例，女43例；年齡18~76歲，平均(46±13)歲；結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]；收集所有患者的晨痰標(biāo)本137例(留取痰標(biāo)本時(shí)護(hù)士應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行指導(dǎo))。2014年7月我院腫瘤科和呼吸科住院的其他肺部疾病患者41例為對(duì)照組，其中男30例，女11例；年齡34~73歲，平均(48±15)歲；15例為肺部腫瘤患者，26例為其他細(xì)菌引發(fā)的呼吸系統(tǒng)炎癥(肺炎12例、支擴(kuò)8例、COPD6例)患者；收集所有患者的晨痰標(biāo)本41份。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DA7600擴(kuò)增儀由中山達(dá)安公司提供；分枝桿菌細(xì)胞破碎儀，SAT試劑盒 (批號(hào)為：20140201)由上海仁度生物科技有限公司提供；改良羅氏培養(yǎng)基由我院檢驗(yàn)科自配。

1.2.2 痰標(biāo)本處理 2倍體積4%NaOH加入痰液中，使痰液充分勻化，室溫放置20min左右。吸取1ml痰混懸液移入1.5ml離心管內(nèi)，13000r/min離心5 min，棄上清，加入1ml生理鹽水重懸洗滌，13000r/min離心 5min，棄上清，加入50μlTB稀釋液重懸。將重懸液放入分枝桿菌細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲處理15min,超聲功率為300W。

1.2.3 SAT-TB擴(kuò)增檢測(cè) 取2μl處理物加入30μl擴(kuò)增檢測(cè)液中，將反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60℃保溫10min后，再置于42℃保溫5min，同時(shí)將酶液預(yù)熱至42℃。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入10μl酶液(含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA轉(zhuǎn)錄酶)，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至DA7600型實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀中啟動(dòng)反應(yīng)程序。反應(yīng)程序?yàn)闊晒馔ǖ涝O(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42℃、1min，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集1次/min，共檢測(cè)40次。樣本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(檢測(cè)時(shí)間)＜40min的樣本為陽(yáng)性樣本。引物序列為 5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATAGGCCGT

CACCCCACCAACAAGCTG-3’ 和 5’ -CCACCCACGGGAUGCAUGCUGG-3’， 探 針 序 列 5’-CCAGCCACGGGAUGCAUGGUGG-3’。 SAT-TB 檢測(cè)全程操作及檢測(cè)時(shí)間約2h。

1.3 同份痰標(biāo)本同時(shí)做涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)及菌種鑒定 涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)操作方法參見(jiàn)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[10]。分枝桿菌菌種鑒定采用的是分離鑒定培養(yǎng)法：利用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌對(duì)PNB(對(duì)硝基苯甲酸)、TCH(噻吩-2-羧酸)二種藥物的耐受性不同，將臨床分離菌株制成菌懸液，接種于含該二種藥物的培養(yǎng)基上，觀察分枝桿菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，可鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)算SAT檢測(cè)痰樣本的靈敏度及特異度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAT-TB檢測(cè)結(jié)果與痰涂片和羅氏培養(yǎng)結(jié)果的對(duì)比 在137例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中SAT-TB檢測(cè)陽(yáng)性率55.5%(76/137)，高于涂片抗酸染色陽(yáng)性率24.8%(34/137)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=26.79,P<0.005)；高于羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率47.4%(65/137)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.77，P>0.05)。

2.2 菌種鑒定結(jié)核分枝桿菌62例，非結(jié)核分枝桿菌3例。

2.3 41例非結(jié)核患者痰標(biāo)本 涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、SAT-TB檢測(cè)均為陰性結(jié)果。見(jiàn)表1。

表1 涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、SAT-TB檢測(cè)結(jié)果

2.4 SAT-TB檢測(cè)不同肺結(jié)核病患者中的檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 不同類型肺結(jié)核病患者SAT-TB檢測(cè)陽(yáng)性率

3 討論

SAT-TB檢測(cè)技術(shù)原理是以結(jié)核分枝桿菌特異的16srRNA為檢測(cè)靶標(biāo)，通過(guò)恒溫RNA擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而快速準(zhǔn)確地判斷待檢樣本中是否有結(jié)核分桿菌存在。與傳統(tǒng)的基于DNA為模板的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)只檢測(cè)活的結(jié)核分枝桿菌，因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌死亡后RNA便降解，但DNA存在于活和死亡的結(jié)核分枝桿菌中，因此SAT-TB技術(shù)的檢測(cè)可作為結(jié)核病是否活動(dòng)性及用藥之后療效的監(jiān)測(cè)[11,12]。

本研究中，SAT-TB檢測(cè)技術(shù)對(duì)肺結(jié)核診斷的敏感性為55.5%，特異性為100.0%。其敏感性與倪麗麗等報(bào)道相近56.5%[13]，但低于沙巍等報(bào)道的58.3%[14]。在3例非結(jié)核分枝桿菌病中(在病例初入選時(shí)全部列為肺結(jié)核病患者)涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)都為陽(yáng)性，但SAT-TB檢測(cè)結(jié)果均為陰性，因此該方法在快速鑒別非結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌時(shí)具有一定的輔助診斷作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，SAT-TB檢測(cè)痰培養(yǎng)陽(yáng)性患者的陽(yáng)性率為95.4%高于痰涂片抗酸染色陽(yáng)性患者的陽(yáng)性率88.2%；有1例患者痰涂片抗酸染色為陽(yáng)性，但羅氏培養(yǎng)和SAT-TB檢測(cè)均為陰性結(jié)果，說(shuō)明SAT-TB技術(shù)只檢測(cè)活的結(jié)核分枝桿菌[15]。

綜上所述，SAT-TB檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)時(shí)間短，敏感度好，特異度高，該方法是一種較有前景的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

[1]王黎霞,成詩(shī)明,陳明亭,等.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

[2]熊國(guó)亮.液基夾層集菌技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中抗酸桿菌對(duì)診斷肺結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(5):412-413.

[3]王盈.聚合酶鏈反應(yīng)與涂片法檢測(cè)對(duì)診斷結(jié)核病的價(jià)值[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):314-315.

[4]張周云,熊國(guó)亮.噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)結(jié)核病臨床診斷的意義[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(1):33-34.

[5]Greco S,Girardi E,Navarra A,et al.Current evidence on diagnostic accuracy based nucleic acid amplification test for the diagnosis of pulmonary tuberculosis[J].Thorax,2006,61:783-790.

[6]Sandin RL.polymerase chain reaction and other amplification techniques in mycobacteriology[J].Clin Lab Med,1996,16:617-639.

[7]Kearns AM,Freeman R.Steward M,et al.A rapid polymerase chain reaction technique for detecting M tuberculosis in a variety of clinical specimens[J].Clin pathol,1998,51:922-924.

[8]Greco S,Rulli M,Girardi E,et al.diagnostic accuracy of in-house PCR for pulmonary tuberculosis in smear-positive patients,metaanalysis and metaregression[J].Clin Microbiol,2009,47:569-576.

[9]衛(wèi)生部.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn) [S].中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),2008：1-5.

[10]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京:中國(guó)教育文化出版社,2006:36.

[11]Pojllock N,Westerling J,Sloutsky A.Specimen solution increases the diagnostic utility of the gen-probe mycobacterium tuberculosis direct test[J].Am JClin Pathol,2006,126:142-147.

[12]Pierxomoni C,Scarparo C,Piccoli P,et al.Petformance assessment of two commercial amplification assays for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex from respiratory and extrapulmonary specimens[J].Chin Microbiol,2002,40:4138-4142.

[13]倪麗麗,羅柳林,景玲杰,等.恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的臨床價(jià)值[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(8):702-705.

[14]沙巍,何婭,蔣瑞華,等.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫放大檢測(cè)(SAT)法對(duì)肺結(jié)核診斷價(jià)值的研究[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(6):377-379.

[15]王易偉,胡頻顏.rRNA擴(kuò)增直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值探討[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(1):543-544.