王 軍，姜文聯(lián)

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院動物科技系， 510640)

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一株水產(chǎn)益生菌的鑒定及其凈水研究

王 軍，姜文聯(lián)

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院動物科技系， 510640)

鑒定1株分離自刺參養(yǎng)殖水體的益生菌DR1，進(jìn)行了常規(guī)生理生化及16S rRNA基因序列分析，將DR1鑒定為馬氏副球菌。進(jìn)一步研究了該益生菌水質(zhì)凈化能力，結(jié)果表明：該菌株能有效降低水體化學(xué)耗氧量(COD)，減少氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)含量。

益生菌；16S rRNA基因；生物學(xué)鑒定；凈水研究

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，大規(guī)模、集約化的養(yǎng)殖模式逐漸取代了粗放、半粗放、半精養(yǎng)的養(yǎng)殖模式。集約化養(yǎng)殖過程中天然餌料已經(jīng)不能完全滿足養(yǎng)殖生物生長的需要，必須補(bǔ)充投喂人工配合飼料，以保證養(yǎng)殖生物的快速生長。不科學(xué)的投喂和管理模式使得飼料的利用率低下，沒有被養(yǎng)殖生物攝食的殘餌以及糞便等有機(jī)物沉入養(yǎng)殖池底，從而造成水體中營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)物大量積累，在水體溶氧不足的情況下經(jīng)不完全氧化轉(zhuǎn)化為對養(yǎng)殖生物有毒有害的氨氮及亞硝酸鹽等物質(zhì)，進(jìn)而引起養(yǎng)殖生物中毒或死亡。

水產(chǎn)益生菌通過氨化、氧化、硝化、反硝化和固氮等作用[1]，將養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的殘餌、糞便以及水體中其他的有害物質(zhì)等迅速地分解為二氧化碳、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等無毒無害的營養(yǎng)物質(zhì)來達(dá)到凈化水質(zhì)的目的，在此過程中水體的溶解氧也得到了提高，以此保證養(yǎng)殖水環(huán)境的潔凈，從而促進(jìn)養(yǎng)殖生物的健康生長。由于其綠色環(huán)保、不產(chǎn)生抗性、無毒副作用、無殘留污染、無記憶性、作用范圍廣等優(yōu)點目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

從刺參養(yǎng)殖池塘水體中分離篩選出1株海洋益生菌DR1。然后采用常規(guī)的生理生化方法和細(xì)菌16S rRNA基因序列測定，進(jìn)行了該菌株的生物學(xué)分類鑒定，并在實驗室條件下研究了該菌株對養(yǎng)殖污水中COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解能力。

1 材料與方法

1.1 待測菌種及培養(yǎng)基

菌株DR1分離自刺參養(yǎng)殖池塘水體中。選用2216E海水培養(yǎng)基：酵母膏 1g，蛋白胨 5g，F(xiàn)ePO40.1g，陳海水 1 000mL，pH=7.6～7.8，瓊脂 2%。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將兩菌株分別接種于2216E固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24h 后，觀察平板上的菌落形態(tài)及表面特征，常規(guī)的檢驗還包括革蘭氏染色、芽孢染色、菌體運(yùn)動性觀察以及形態(tài)觀察，具體方法和步驟參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《微生物學(xué)實驗技術(shù)》[2-3]。

1.3 生理生化指標(biāo)測定

測定菌株DR1的生理生化特性，具體鑒定內(nèi)容及方法參照武心華《刺參池塘有機(jī)物降解菌固定化及其對水質(zhì)凈化作用研究》[4]進(jìn)行。

1.4 待測菌株的16S rRNA基因序列鑒定和分析

1.4.1 PCR模板制備

將細(xì)菌接種在平板上，28℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于50 L無菌蒸餾水中，于100℃水浴加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA。

1.4.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與測序

以細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增常用引物27F(5'-A G A G T T T G A T CC T G G C T CA G -3')和1492R(5'-A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T -3')為PCR引物。 采用50μL的反應(yīng)體系，擴(kuò)增模板DNA，并交由相關(guān)測試公司(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)進(jìn)行序列測定。

1.4.3 16S rRNA基因的序列分析及數(shù)據(jù)處理

將菌株 DR1的 16S rRNA基 因序列與從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得的細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對，采用ClustalX、BioEdit和MEGA4.1等軟件對菌株DR1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，用Neighbor-Joning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1000次RePlications，計算Bootstrap值評估樹的置信度，對DR1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 水質(zhì)凈化研究

將經(jīng)過2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期的DR1培養(yǎng)液離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次后重懸作為水質(zhì)凈化研究的接種菌液，并用血球計數(shù)板計數(shù)菌濃度。本實驗按施用終濃度1.0×l06cfu/mL接種于盛有3L養(yǎng)殖污水的三角瓶中，以不加菌的處理作為對照組，每個處理設(shè)5個重復(fù)，每天定時取樣測定水體中COD、氨氮及亞硝酸鹽含量，連續(xù)監(jiān)測一周。水體中COD、氨氮、亞硝酸鹽測定方法參照照雷衍之《養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實驗》[5]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

熒光顯微鏡下DR1菌體呈球狀，無鞭毛，無芽孢，2216E平板上培養(yǎng)48～72h，肉眼觀察菌落呈橘黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊、表面較濕潤光滑。

2.2 生理生化指標(biāo)測定結(jié)果

菌株DR1生理生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株生理生化特性

可以看出，該菌株為低溫種，在水溫超過25℃，菌體生長明顯受到抑制，最適生長溫度10～18℃。DR1對鹽度的適應(yīng)范圍較廣，在0～4%的水體中均能正常生長。

2.3 16S rRNA 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株DR1的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與該菌株序列同源性最高的絕大多數(shù)為副球菌屬的細(xì)菌，選取相關(guān)菌株的16S rRNA序列用Neighbour-Joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。如圖1所示，菌株DR1與副球菌屬的Paracoccus marcusii(EF491972)序列相似性達(dá)99%以上，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性，將菌株DR1初步鑒定為馬氏副球菌。

圖1 DR1的16S rDNA 基因序列聚類分析結(jié)果

2.4 DR1凈水結(jié)果

菌株DR1對水體中COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解效果見圖2。

圖2 DR1對水體COD、氨氮及亞硝酸鹽的降解

由圖2可以看出，與對照組相比，施加DR1可以明顯降低養(yǎng)殖廢水中的化學(xué)耗氧量(COD)，間接提高水體中溶解氧供養(yǎng)殖生物呼吸作用。同時，添加DR1的處理組，氨氮1周內(nèi)由0.9mg/L迅速降低到0.15mg/L，達(dá)到安全濃度；而水體中的亞硝酸鹽也由0.3mg/L降低到0.05mg/L，而對照組2個指標(biāo)在此過程中均有所上升。

3 討論

根據(jù)常見細(xì)菌的鑒定方法，菌株DR1屬于革蘭氏陰性球狀菌；菌株好氧，無運(yùn)動能力；接觸酶、氧化酶陽性；不產(chǎn)芽孢；不能利用檸檬酸鹽，硝酸鹽還原陽性。具有上述顯著特征的代表是副球菌屬菌株。

16S rRNA作為一種重要的核酸水平鑒定工具，其顯著特點就是能及時鑒定出生長緩慢或生化惰性、細(xì)菌培養(yǎng)陰性以及非常規(guī)的菌株[6]。近年來，大量細(xì)菌的16S rRNA序列已被檢測并被NCBI等國際基因數(shù)據(jù)庫收錄，成為目前細(xì)菌鑒定和分類的主要參照系統(tǒng)，并得到NASA、FDA、TIGR、NIAID等多個國際權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可[7-8]。從16S rRNA基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上看，菌株DR1與Paracoeeus marcusii聚為一群，具有最高的相似性。從形態(tài)、生理、生化、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、16S rRNA基因序列同源性等方面分析，菌株DR1可鑒定為馬氏副球菌。

水中氨態(tài)氮含量增加會抑制魚體內(nèi)的氮排泄，損害養(yǎng)殖生物鰓等器官組織，消耗水中溶解氧；亞硝態(tài)氮毒性較強(qiáng)，是養(yǎng)殖水域中誘發(fā)暴發(fā)性疾病的重要因素，因此去除水體中過量的氨氮、亞硝態(tài)氮對于改善水質(zhì)、提高養(yǎng)殖生物成活率和生長率、保護(hù)環(huán)境等具有重要意義。水體有益微生物能通過降低水體中有機(jī)物含量，以及一系列的消化、反硝化作用，降低水體中氨氮、亞硝酸鹽的含量，提高水體溶氧，是進(jìn)行養(yǎng)殖生態(tài)防治重要手段。本文在實驗室條件下，研究了DR1對養(yǎng)殖污水的凈化能力，結(jié)果顯示，在小水體中，DR1對水體化學(xué)耗氧量(COD)、氨氮、亞硝酸鹽均有較好的降解能力，可以作為商業(yè)微生態(tài)制劑開發(fā)材料。

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