陳曉寧，陳雅娟，王 京，靳鐵治，侯 祥*

(1.陜西省動(dòng)物研究所，陜西 西安 710032；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

復(fù)合不育劑EP-1對(duì)雄性棕色田鼠的抗生育作用

陳曉寧1，陳雅娟2，王 京1，靳鐵治1，侯 祥1*

(1.陜西省動(dòng)物研究所，陜西 西安 710032；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

為探討復(fù)合不育劑EP-1對(duì)雄性棕色田鼠繁殖器官的藥效，選取健康的發(fā)情期成年雄性棕色田鼠22只，隨機(jī)分成2組，記錄2組用藥前及用藥后睪丸、附睪、儲(chǔ)精囊、精子密度、睪酮含量和睪丸組織形態(tài)的變化。結(jié)果顯示 EP-1對(duì)雄性黑線姬鼠具有明顯的不育效果，實(shí)驗(yàn)組試鼠睪丸組織破壞嚴(yán)重，精子密度及睪酮含量較對(duì)照組降低。說明復(fù)合不育劑(EP-1)能對(duì)雄性中華姬鼠的生殖系統(tǒng)造成一定的影響。

棕色田鼠；EP-1；不育控制

我國(guó)鼠害嚴(yán)重，統(tǒng)計(jì)表明1987-2012年之間，每年農(nóng)田害鼠發(fā)生面積在0.2～0.4億hm2之間，且呈逐年上升趨勢(shì)，由鼠害造成的糧食減產(chǎn)占總產(chǎn)量的5%～10%。在害鼠數(shù)量控制方面，傳統(tǒng)的化學(xué)滅殺法存在種群反彈、環(huán)境污染和天敵二次中毒等問題，尋找無公害的方法來控制害鼠的種群數(shù)量具有重要的意義，其中不育控制已成為研究的熱點(diǎn)[1-5]。

不育控制理論最初由Knipling提出[6]，其實(shí)質(zhì)是生育率控制(Birth control)[1,3]，國(guó)內(nèi)對(duì)不育控制的研究主要集中在種群動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型分析、藥理和藥效檢測(cè)及野外控制實(shí)驗(yàn)三個(gè)方面[7]。國(guó)內(nèi)已報(bào)道了以炔雌醚和左炔諾孕酮為主成分的復(fù)方不育劑(EP-1)對(duì)布氏田鼠(Microtusbrandti)、灰倉(cāng)鼠(Cricetulusmigratorius)、子午沙鼠(Merionesmeridianus)、大倉(cāng)鼠(Tscherskiatriton)、長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesmeridiatus)、黑線毛足鼠(Phodopuscampbelli)、東方田鼠(Microtusfortis)[4-5,8-10]等有明顯的不育效果。然而，EP-1是否對(duì)陜西境內(nèi)重要害鼠棕色田鼠具有不育效果還未見報(bào)道。

棕色田鼠(Microtusmandarinus)是陜西境內(nèi)的主要害鼠，主要危害陜西北部旱作區(qū)的農(nóng)田和果樹。為探索EP-1對(duì)雄性棕色田鼠的不育效果，本實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)環(huán)境下通過對(duì)雄性黑線姬鼠進(jìn)行不育控制實(shí)驗(yàn)，研究EP-1對(duì)雄性棕色田鼠生殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試鼠: 實(shí)驗(yàn)鼠來自陜西師范大學(xué)動(dòng)物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的棕色田鼠實(shí)驗(yàn)種群。實(shí)驗(yàn)開始前所有試鼠均于37 cm ×27 cm ×17 cm 的塑料飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)。所有試鼠給予充足的食物和水，飼養(yǎng)房光照保持14L:10D，室溫保持在18～22 ℃。

EP-1: 左炔諾孕酮和炔雌醚原藥購(gòu)買自北京紫竹天工科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

EP-1按照左炔諾孕酮∶炔雌醚 =2∶1比例混合均勻，以芝麻油為溶劑配制成懸濁液備用。選健康的發(fā)情期成年雄性棕色田鼠22只(28.31±0.51 g)，分為給藥組12只(28.92±0.57 g)和對(duì)照組10只(27.57±0.86 g)，試鼠給藥組及對(duì)照組體重差異均不顯著(t檢驗(yàn)，P>0.05)。采用灌胃法對(duì)給藥組按10 mg/kg一次性給藥，給藥后15 d對(duì)所有試鼠進(jìn)行剖檢。

1.3 指數(shù)測(cè)定

臟器系數(shù): 用乙醚深度麻醉試鼠，取雙側(cè)睪丸、附睪、儲(chǔ)精囊，用萬分之一電子天平稱重(g)。

精子計(jì)數(shù): 取左側(cè)附睪，放入1 ml的37 ℃生理鹽水中盡量剪碎并于200目濾網(wǎng)過濾，正式計(jì)數(shù)前搖勻液體，并在血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。

睪酮含量: 眼球取血后，采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血清睪酮含量。

睪丸組織形態(tài): 剖檢后取雙側(cè)睪丸置于10%福爾馬林溶液中，標(biāo)記保存，制作石蠟切片并經(jīng)HE染色后鏡檢。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在SPSS for windows 18.0 軟件上分析，每一組繁殖生理指標(biāo)均比較處理組與對(duì)照組，以及不同處理組之間的差異。對(duì)所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(Independent Samples T Test)比較差異的顯著性，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用非參檢驗(yàn)(Mann-Whitney U Test)比較差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 EP-1對(duì)雄性棕色田鼠繁殖器官的影響

給藥后第15 d，實(shí)驗(yàn)鼠主要生殖器官與對(duì)照組相比發(fā)生了不同程度的變化，實(shí)驗(yàn)鼠睪丸(P<0.01)、附睪(P<0.01)和儲(chǔ)精囊(P<0.01)的重量平均值均極顯著低于對(duì)照組(表1)。給藥組的睪丸、附睪和儲(chǔ)精囊均發(fā)生了較為嚴(yán)重的萎縮，表明EP-1對(duì)雄性棕色田鼠的生殖可能會(huì)產(chǎn)生不利的影響。

表1 EP-1灌胃15 d后雄性棕色田鼠繁殖器官指數(shù)

注：“C”表示對(duì)照組;“T”表示實(shí)驗(yàn)組；aMean±S.E. g,N=4；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 EP-1對(duì)精子密度和睪酮含量的影響

EP-1給藥處理造成雄性棕色田鼠精子密度與睪酮含量下降。給藥組在15 d時(shí)精子密度(0.75±0.08)×107/ml與對(duì)照組(0.19±0.04)×107/ml差異極顯著(P<0.01)，精子密度下降幅度為74.67%。

給藥組睪酮水平顯著下降，與對(duì)照組(573.64±20.08) pg/ml相比，在給藥后第15 d睪酮水平(493.23±19.78) pg/ml明顯下降，差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。這表明EP-1抑制了雄鼠睪酮的分泌。睪酮是協(xié)同誘導(dǎo)雄鼠精子發(fā)育和成熟的重要激素，它的分泌量下降會(huì)導(dǎo)致精子的發(fā)育異常。

2.3 EP-1對(duì)睪丸組織形態(tài)的影響

給藥后第15 d，給藥組(106.38±23.18 μm)的睪丸組織曲細(xì)精管平均管徑均較對(duì)照組(166.18±28.28 μm)出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)，對(duì)照組試鼠的曲細(xì)精管從外向內(nèi)，各級(jí)精細(xì)胞排列有序，精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和精細(xì)胞均發(fā)育良好。EP-1給藥后第15 d，試鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)部呈潰瘍狀且半數(shù)以上出現(xiàn)空腔，管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞疏松且不同程度受損，生精細(xì)胞排列紊亂。最為顯著的是，在處理組的所有睪丸組織切片中幾乎沒有觀察到有晚期精子細(xì)胞的生成，而對(duì)照組中，可以明顯地觀察到數(shù)量較多的晚期精子細(xì)胞。說明EP-1可以導(dǎo)致中華姬鼠的睪丸內(nèi)精母細(xì)胞發(fā)育異常，造成曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)破壞，且能抑制精子的正常發(fā)育和成熟。

3 討論

嚙齒動(dòng)物種群的繁殖能力與雌雄個(gè)體繁殖器官的正常發(fā)育密切相關(guān)。過量的雌激素?cái)z入會(huì)通過負(fù)反饋途徑來抑制下丘腦-垂體-性腺軸系(H-P-G軸),從而阻礙睪酮分泌和精子生成[11]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)左炔諾孕酮和炔雌醚的混合物EP-1能顯著降低棕色田鼠的生殖器官重量和精子生成，并同時(shí)顯著降低血清睪酮水平，這些結(jié)果顯示EP-1是通過抑制H-P-G軸的功能來實(shí)現(xiàn)雄性不育的。已有研究表明EP-1對(duì)多種雄鼠有較好的不育效果[4-5]，但該藥物對(duì)雄性黑線毛足鼠則不表現(xiàn)出明顯的抗生育效果[9]。這可能是由于左炔諾孕酮和炔雌醚對(duì)不同鼠種的抗生育作用不同，也可能由于合理給藥劑量在不同鼠種間存在差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合不育劑(EP-1)能夠?qū)е滦坌宰厣锸笊称鞴倜黠@萎縮、變小，尤其是對(duì)附睪的影響最為顯著。睪丸組織切片顯示EP-1導(dǎo)致了曲細(xì)精管官腔異常率增高，精子發(fā)育異常，這可能與睪酮的分泌受到抑制有關(guān)。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾進(jìn)行過10 mg/kg單次灌胃與多次灌胃的比較，發(fā)現(xiàn)除了睪酮水平有顯著差異外，其他各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異，說明間隔多次給藥與單次給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠生理生殖的影響無明顯區(qū)別，因此一次性給藥即可達(dá)到抑制實(shí)驗(yàn)鼠繁殖的目的，無需重復(fù)給藥。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)棕色田鼠進(jìn)行EP-1給藥后，其大部分個(gè)體仍能參加交配活動(dòng)。生態(tài)學(xué)理論證明，若鼠類種群中的部分個(gè)體發(fā)生不育，且不育個(gè)體可以繼續(xù)占據(jù)原生態(tài)位，保衛(wèi)領(lǐng)地并攻擊入侵者，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)種群增長(zhǎng)的長(zhǎng)期控制。此外，本試驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)10 mg/kg的給藥劑量對(duì)試鼠有致死作用，且未發(fā)現(xiàn)EP-1影響試鼠后代的生長(zhǎng)發(fā)育，表明該藥物對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物和人類的傷害較小，不會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)劇烈波動(dòng)，又有可能抑制邊緣種群的增長(zhǎng)，從理論上講是一種很有潛力的控制鼠害發(fā)生的策略。

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Antifertility Effect of EP-1 Contraceptive Compound on MaleMicrotusmandarinus

CHEN Xiao-ning1,CHEN Ya-juan2,WANG Jing1,JIN Tie-zhi1,HOU Xiang1*

(1.ShaanxiInstituteofZoology,Xi'an，Shaanxi710032; 2CollegeofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi'an,Shaanxi710062)

In order to explore the effect of EP-1 on reproductive system of maleMicrotusmandarinus,22 adult maleMicrotusmandarinuswere selected and randomly divided into 2 groups. Record was made about the changes of the testis,Epididymides,seminalvesicle,sperm density,testosterone and testicular tissue morphology before and after treated with EP-1. The testicular tissue of the treated groups were severely damaged and the sperm density and testosterone level of treated groups were lower than the control group. The result showed that EP-1 had significant effect on maleMicrotusmandarinus.

Microtusmandarinus;EP-1; anti-fertility

2015-03-21

陜西省科學(xué)院重點(diǎn)及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2014K-38)；陜西省科學(xué)院青年基金項(xiàng)目(2013K-28)；陜西省自然科學(xué)基金(2012JM3013);陜西省自然科學(xué)基金(2014Jm2-3035)

陳曉寧(1985- )，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)研究。

*通訊作者：侯 祥。E-mail: hx426108@163.com。

Q492

A 文章編號(hào):1001-2117(2015)03-0010-03