朱佳莉

羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)的測定方法優(yōu)化

朱佳莉

（上海新亞藥業(yè)有限公司新先鋒藥廠，上海201203）

對用現(xiàn)有國家標準中羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)的方法測定過程中可能出現(xiàn)的問題進行了分析，并對原有的測定方法進行了優(yōu)化，以達到更好的分離效果，使得有關(guān)物質(zhì)間的分離明顯改善。

羧芐西林鈉；有關(guān)物質(zhì)；液相色譜；方法優(yōu)化

0 引言

羧芐西林鈉為廣譜青霉素類抗生素，通過抑制細菌細胞壁合成發(fā)揮殺菌作用。對大腸埃希菌、變形桿菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、沙門菌屬和志賀菌屬等腸桿菌科細菌，以及銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、奈瑟菌等其他革蘭陰性菌具有抗菌作用。羧芐西林鈉主要適用于系統(tǒng)性銅綠假單胞菌感染，如敗血癥、尿路感染、呼吸道感染、腹腔、盆腔感染以及皮膚、軟組織感染等，也可用于其他敏感腸桿菌科細菌引起的系統(tǒng)性感染。

有關(guān)物質(zhì)是指在生產(chǎn)過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應(yīng)產(chǎn)物，以及儲藏過程中的分解產(chǎn)物等。有關(guān)物質(zhì)研究是藥品質(zhì)量研究中關(guān)鍵性的項目之一，其含量是反映藥品純度的直接指標。

高效液相色譜法（HPLC）是一種現(xiàn)代液相色譜法，其工作原理：用高壓輸液泵將流動相泵入到裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動相帶入柱內(nèi)進行分離后，各成分先后進入檢測器，數(shù)據(jù)處理裝置對各種測量數(shù)據(jù)進行記錄和處理，完成定性定量分析工作。由于高效液相色譜法采用了高壓流動相、高效固定相和高靈敏度檢測器，與其他色譜法相比，其具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、適用范圍寬等特點，已成為醫(yī)藥研究的有力工具。

1 用現(xiàn)行標準測定可能發(fā)生的問題

羧芐西林鈉，英文名Carbenicillin Sodium for Injection，化學(xué)名為［6S-（2a，5a，6b）］-［（羧苯基-乙基）氨基］-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)［3.2.0］庚烷-2-甲酸二鈉鹽。

分子式：C17H16N2Na2O6S。分子量：422.4。

1.1 現(xiàn)行標準測定要求

現(xiàn)行標準為國家食品藥品管理局起草的藥品標準（WS1-C2-0042-89-2011），按該方法測定羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)，其過程如下：

1.1.1 儀器與試藥

儀器：Aglient 1260，HPLC主要組成參數(shù)如表1所示。

表1 Aglient 1260 HPLC主要組成參數(shù)

羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)測定試藥如表2所示。

表2 羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)測定所用試藥

1.1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18 4.6×250；波長：230 nm；流速：1m L/m in。

溶劑：取磷酸二氫鈉7.8 g，加水溶解并稀釋至900m L，用1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4，用水稀釋至1 000m L。

供試品配制：精密稱定，加溶劑溶解并稀釋成1m L中含3mg的溶液。

對照品配制：取青霉素對照品，精密稱定，加溶劑溶解并定量稀釋成1m L中含28μg的溶液。

計算：青霉素以無水物計，按外標法以峰面積計算。

流動相A：0.1moL/L磷酸二氫鈉溶液（調(diào)節(jié)pH值至4.3）-乙腈（98∶2）。

流動相B：乙腈。

梯度洗脫程序如表3所示。

表3 梯度洗脫程序

1.2 測定結(jié)果

以羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果中雜質(zhì)個數(shù)最多的3批原料產(chǎn)品為例，其測定圖譜分別如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 測定結(jié)果圖譜之1

圖2 測定結(jié)果圖譜之2

圖3 測定結(jié)果圖譜之3

1.3 結(jié)果討論

通過對本廠生產(chǎn)的65批羧芐西林鈉產(chǎn)品進行有關(guān)物質(zhì)的測定。其中，原料32批，對應(yīng)制劑34批。用此梯度洗脫方法，有一些雜質(zhì)峰未能完全分離。其中，雜質(zhì)4和5的分離度非常不好。

針對羧芐西林鈉有不良反應(yīng)的投訴，需要對羧4.3，pH值過低，超出緩沖的緩沖范圍。該溶液原有pH值為4.4，直接使用，不調(diào)節(jié)，雜質(zhì)分離效果優(yōu)化。

2.1.2 色譜柱選擇

試用不同品牌色譜柱，有的出峰時間過早，有的分離效果不好。圖4、圖5為某不同品牌色譜柱出峰時間過早與分離效果不好的圖譜。芐西林鈉的有關(guān)物質(zhì)檢測方法進行優(yōu)化，并對部分已知雜質(zhì)進行定位，以求建立雜質(zhì)圖譜檔案，更好地對羧芐西林鈉進行質(zhì)量監(jiān)控。

圖4 某一品牌色譜柱出峰時間過早與分離效果不好的圖譜

2 測定方法優(yōu)化

2.1 色譜條件

2.1.1 流動相選擇

流動相B為磷酸鹽溶液，原標準中規(guī)定pH值為

考慮標準規(guī)定主峰保留時間約為20min，結(jié)合各雜質(zhì)的分離情況，對比大量圖譜后，最終選擇了Sapphire C18色譜柱。

2.1.3 梯度洗脫程序的優(yōu)化

經(jīng)多次試驗，現(xiàn)將梯度洗脫程序進行優(yōu)化，其參數(shù)如表4所示。

2.1.4 其他色譜條件

儀器與試藥、供試品的配制、對照品的配制均與原法相同。

圖5 另一品牌色譜柱出峰時間過早與分離效果不好的圖譜

表4 梯度洗脫程序的優(yōu)化

2.2 溶液穩(wěn)定性考察

當(dāng)樣品放置10m in，或者樣品進樣時溫度過高，會加速雜質(zhì)的生成。其中，雜質(zhì)3明顯增大，雜質(zhì)15則消失，其圖譜如圖6所示。

2.3 優(yōu)化測定結(jié)果

（1）對幾個已知雜質(zhì)分別進行定位。

（2）測定3批雜質(zhì)最多的產(chǎn)品圖譜，并重新進行定位。圖7為對照品圖譜，圖8、圖9、圖10為供試品圖譜。

（3）測定31批新生產(chǎn)的羧芐西林鈉樣品，測試結(jié)果顯示方法穩(wěn)定。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

2.4.1 精密度試驗

以對照品青霉素計RSD%=1.44%。

2.4.2 其他系統(tǒng)參數(shù)

圖6 加速雜質(zhì)的生成的圖譜

圖7 對照品圖譜

圖8 供試品圖譜1

圖9 供試品圖譜2

以130202批號為例，所有塔板數(shù)均大于4 000，分離度除D、G外均符合要求，D、G雖未達到1.5的要求，但是也已經(jīng)實現(xiàn)基本分離。

2.4.3 空白測試

空白測試圖譜如圖11所示。

圖10 供試品圖譜3

圖11 空白測試圖譜

2.5 樣品測定結(jié)果比較

用優(yōu)化后的梯度洗脫方式測定，雜質(zhì)F和G（即原來的雜質(zhì)4和5）分離效果明顯改善。全部雜質(zhì)能夠多定位出3個雜質(zhì)峰。

3 結(jié)語

對現(xiàn)有國家標準中羧芐西林鈉有關(guān)物質(zhì)的測定方法進行優(yōu)化，以達到更好的分離效果。因此，該優(yōu)化方法可用于羧芐西林鈉產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)的跟蹤測定。具體優(yōu)化結(jié)論：

（1）流動相的配制：原標準中流動相A中混合了乙腈，為使溶劑更穩(wěn)定，采用溶劑與有機相分開，儀器自動混合的方式；磷酸二氫鈉溶液配制時，應(yīng)盡量精密稱定，保持流動相的統(tǒng)一性；配制流動相時，不用調(diào)節(jié)pH值；流動相在每次做樣品時，要新鮮配制。

（2）供試品溶液：由于羧芐西林鈉溶液分解速度很快，供試品配制時要臨用新配；放置時間不宜超過5m in。

（3）色譜圖記錄時間：為達到雜質(zhì)分離度要求，使所有雜質(zhì)全部洗脫，總洗脫時間增加至80min。

（4）色譜柱選擇：Sapphire C18色譜柱。

（5）有關(guān)物質(zhì)中明顯的峰的編號：標出A～S及青霉素共20個峰。

（6）對一些已知雜質(zhì)的定位結(jié)果：雜質(zhì)6-APA，未檢出（出峰時間在A峰之前）；雜質(zhì)苯丙二酸為F峰；雜質(zhì)D為4個物質(zhì)的混合物，分別為C、D、E、F峰；雜質(zhì)苯乙酸為O峰；雜質(zhì)G為2個物質(zhì)的混合物，分別為N、O峰。

2014-12-23

朱佳莉（1980—），女，上海人，助理工程師，研究對象：有關(guān)物質(zhì)的液相色譜分析。