張 瑩， 李 曦， 張 莉， 林陽生， 肖忠海， 宿 莊， 劉 穎， 楊丹鳳△

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 呼和浩特 010059； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

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急性冷暴露對大鼠肺組織中促炎性因子表達(dá)的影響*

張 瑩1,2， 李 曦2， 張 莉2， 林陽生2， 肖忠海2， 宿 莊1， 劉 穎1， 楊丹鳳2△

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 呼和浩特 010059； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

目的：觀察急性冷暴露大鼠肺部炎癥反應(yīng)及病理學(xué)損傷的變化情況，探討冷應(yīng)激對肺損傷的可能機(jī)制。方法：40只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為5組(n=8)，即對照組，-25℃ 0.5 h組、-25℃ 1 h組、-25℃ 2 h組和-25℃ 2.5 h組。除對照組外，其他各組均在溫度為-25℃、無風(fēng)的低溫艙內(nèi)暴露。在冷暴露前后分別測定直腸溫度，冷暴露后取材在光鏡下觀察肺組織學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測肺組織勻漿中促炎性因子的表達(dá)。結(jié)果：在急性冷暴露后，與對照組相比，-25℃ 1 h組、-25℃ 2 h組和-25℃ 2.5 h組暴露前后體心溫度明顯降低，其差值升高(P<0.05)。-25℃ 2.5 h組肺組織學(xué)分析出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤和肺泡內(nèi)水腫液。-25℃ 1 h組、-25℃ 2 h組和-25℃ 2.5 h組肺組織勻漿中促炎性因子的濃度升高(P<0.05)。結(jié)論：急性冷暴露后，肺組織出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤和促炎性因子水平增加，從而導(dǎo)致肺組織損傷。

急性冷暴露；肺；炎性反應(yīng)；大鼠

呼吸道直接與外界相通，所以肺與外界環(huán)境接觸極為密切。在嚴(yán)寒條件下，氣溫低、濕度低，機(jī)體吸入干冷的空氣導(dǎo)致上、下呼吸道生理學(xué)改變，而使呼吸系統(tǒng)功能改變?nèi)绾粑贝?、喘息、長期咳嗽或是咳嗽發(fā)作及粘液分泌物增多等[1]。在嚴(yán)寒地區(qū)及冬季，隨著外界環(huán)境溫度的降低，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率增加[2-6]。本文通過觀察大鼠急性冷暴露后肺組織病理形態(tài)學(xué)及促炎性因子表達(dá)水平的改變，以進(jìn)一步揭示急性冷暴露對肺組織損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性清潔級的Wistar大鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供)40只，體重180～220 g，飼以普通飼料，自由飲水。暴露前均在室溫為(23±2)℃的SPF級動物房中適應(yīng)4 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：12導(dǎo)人體溫度測定儀器購自新加坡Eutech Instruments 有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及冷暴露方法 動物在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組(n=8)，冷暴露組置于溫度為-25℃，風(fēng)速為0 m/s的低溫艙，暴露時間分別為0.5、1、2、2.5 h，每只動物均采用單籠暴露方式；對照組以相同方式暴露在(23±2)℃環(huán)境艙內(nèi)2.5 h。

1.2.2 體心溫度測定 所有實(shí)驗(yàn)大鼠在入艙前將測溫探頭蘸取少許甘油后，輕柔地插入大鼠肛門3 cm處，待數(shù)值穩(wěn)定后讀數(shù)。于不同時間的冷暴露后出艙立即測定直腸溫度。

1.2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸取出肺臟，右肺中葉行4%中性甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。肺組織勻漿的制備：以每克肺組織加入10 ml生理鹽水，在玻璃勻漿器中冰浴研磨制成10%肺組織勻漿，以3 500 r/min離心10 min，上清液分裝貯存于-20℃。

1.2.4 肺組織勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β濃度測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性冷暴露對大鼠體心溫度的影響

暴露前各冷暴露組與對照組及冷暴露組之間體心溫度無差別。大鼠在-25℃的寒冷溫度暴露后，隨著暴露時間的延長，與暴露前相比，各實(shí)驗(yàn)組暴露后的體心溫度均降低且差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，-25℃ 1 h、2 h和2.5 h組暴露前后體心溫度的差值升高，差異顯著 (P<0.05)；與-25℃1 h組相比，-25℃ 2 h和2.5 h組暴露前后體心溫度的差值顯著升高(P<0.05 ，表1)，結(jié)果表明冷暴露時間愈長，體心溫度降低愈嚴(yán)重。

GroupBefore After Control37.91±0.4237.58±0.45-25℃0.5h37.96±0.3036.43±0.82*▲-25℃1h37.84±0.5335.83±0.88*▲-25℃2h37.83±0.5432.66±2.31*#△▲-25℃2.5h37.88±0.3726.38±5.05*#△▲

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs25℃ 0.5 h group；△P<0.05vs25℃ 1 h group；▲P<0.05vsbefore cold exposure in the same group

2.2 各組肺組織病理學(xué)改變

光鏡下，對照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰、擴(kuò)張均勻，肺泡壁薄，肺泡壁及間質(zhì)內(nèi)無明顯的水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤。-25℃ 0.5 h、-25℃ 1 h、-25℃ 2 h和-25℃ 2.5 h組均為肺中度間質(zhì)性炎癥，出現(xiàn)不同程度的肺泡間隔增寬，單核細(xì)胞浸潤，肺泡擴(kuò)張和塌陷及肺泡內(nèi)含有水腫液。-25℃ 2.5 h組有些區(qū)域肺實(shí)變?yōu)橹囟妊装Y，大量炎細(xì)胞浸潤，有的肺泡內(nèi)充滿分葉核白細(xì)胞或吞噬細(xì)胞，支氣管內(nèi)也可見充有炎細(xì)胞和吞噬細(xì)胞(圖1，見彩圖頁Ⅱ)，表明冷暴露時間愈長，肺組織損傷愈嚴(yán)重。

2.3 各組肺組織細(xì)胞因子濃度的變化

與常溫對照組相比，-25℃1 h、2 h及2.5 h組TNF-α和IL-6水平均顯著升高，TNF-α水平-25℃ 1 h、2 h及2.5 h組均高于-25℃ 0.5 h組(P<0.05)-25℃ 2 h組，2.5 h組IL-6水平明顯高于-25℃ 0.5 h及1 h組，-25℃ 2 h和2.5 h組IL-1β水平明顯高于常溫對照組(P<0.05，表2)。結(jié)果表明隨著冷暴露時間愈長，肺組織細(xì)胞促炎性因子水平升高。

GroupTNF-αIL-6IL-1βControl7.46±1.442.05±0.18107.85±26.55-25℃0.5h20.53±2.97*4.67±0.51*117.54±13.04-25℃1h25.9±3.52*#5.60±1.59*125.61±11.03-25℃2h27.57±1.96*#8.05±1.92*#△136.24±15.35*-25℃2.5h28.21±3.36*#9.28±2.41*#△157.09±28.33*

TNF-α: Tumor necrosis factorα: IL: Interleukin

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs25℃ 0.5 h group；△P<0.05vs-25℃ 1 h group

3 討論

低溫引起的呼吸系統(tǒng)癥狀和肺功能障礙可能導(dǎo)致明顯的冬季作業(yè)能力降低。在寒冷環(huán)境下，反射性地鼻和上呼吸道的血管收縮，抑制呼吸系統(tǒng)的防御功能并且使亞臨床癥狀的病毒性感染轉(zhuǎn)變?yōu)橛邪Y狀的臨床感染[7]。肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能降低，以致清除細(xì)菌的能力大為減退，這種變化使上呼吸道“自身菌”侵入下呼吸道的機(jī)會增加[8]。過度吸入冷空氣，導(dǎo)致氣道表面液體蒸發(fā)，從而形成干燥和高滲狀態(tài)，而在易感個體可以直接造成氣道上皮的損傷；氣道表面液體的高滲狀態(tài)，引起嗜酸性細(xì)胞或是肥大細(xì)胞的釋放，如白三烯、前列腺素和組胺等介質(zhì)，增加血管的通透性，引起上皮損傷[9]。當(dāng)體心溫度降至35℃以下時稱為低體溫，常被分為輕、中、重度三類，輕度體心溫度為35℃～32℃，中度體心溫度32℃～28℃，重度體心溫度<28℃[10]。本研究結(jié)果顯示，-25℃ 2 h和-25℃ 2.5 h組在急性冷暴露之后體心溫度下降，分別達(dá)到中度和重度的水平而出現(xiàn)肺組織損傷，且隨冷暴露程度而加重。因纖毛功能的損傷，保護(hù)性氣道反應(yīng)降低，這樣傾向于肺炎的發(fā)生[10]，有可能在這一條件下增加呼吸系統(tǒng)疾病的易感性。

急性冷暴露于冷空氣中導(dǎo)致下呼吸道的炎性細(xì)胞(粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)數(shù)目增多[11]，本實(shí)驗(yàn)的組織學(xué)結(jié)果顯示在-25℃ 2 h組出現(xiàn)了大量炎性細(xì)胞的浸潤。而在不同的暴露時間條件下，其肺組織病檢出現(xiàn)單核細(xì)胞的浸潤，寒冷刺激增加單核細(xì)胞的募集，可能是由明顯的交感神經(jīng)興奮介導(dǎo)，單核細(xì)胞的激活與許多介質(zhì)的釋放有關(guān)，特別是細(xì)胞因子的釋放[12，13]，募集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞這類炎性細(xì)胞到呼吸道是宿主遇到外界有害因素的防御反應(yīng)，但是過多的炎性細(xì)胞可以釋放彈性蛋白酶和氧自由基，引起肺組織的損傷。

從-25℃ 1 h及以后的寒冷暴露組可以看出，隨冷暴露時間的延長，大鼠肺組織勻漿中TNF-α和IL-6的濃度持續(xù)升高，這些炎性因子直接募集中性粒細(xì)胞或是激活肺泡上皮細(xì)胞釋放黏附分子來增加中性粒細(xì)胞的浸潤。其他實(shí)驗(yàn)也顯示冷暴露刺激單核細(xì)胞分泌促炎性因子，例如IL-1，TNF-α和IL-6這些炎性因子的濃度升高[14]。TNF-α對多形中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞有趨化作用，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，它還可刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和IL-6，引起放大和連鎖效應(yīng)，即瀑布效應(yīng)。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞為主的免疫活性細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，增強(qiáng)白細(xì)胞的聚集、遷移至局部損傷部位，導(dǎo)致組織炎性細(xì)胞的浸潤，加重肺損傷。IL-1β是肺損傷中另一具有重要作用的介質(zhì)。其誘導(dǎo)肺損傷的可能機(jī)制：(1)增加血管內(nèi)皮通透性。(2)協(xié)同TNF-α，加重TNF-α誘發(fā)的肺損傷。(3)誘導(dǎo)粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，對粒細(xì)胞具有趨化和激活作用[15]。經(jīng)非炎性或是炎性媒介的激活，單核細(xì)胞隨后釋放許多的細(xì)胞因子，包括TNF-a, IL-1β, IL-6, and IL-1 receptor antagonist(IL-1ra)，在組織損傷過程中，許多的炎性因子調(diào)節(jié)單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和隨后的跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[16]。這些炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)的相互作用，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致肺間質(zhì)性肺水腫，肺泡上皮屏障破壞，從而造成肺組織損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，在急性寒冷應(yīng)激之后，暴露時間愈長，肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞的浸潤和肺泡內(nèi)水腫液的增加更加明顯，而且肺組織中促炎性因子水平顯著升高，從而對肺組織造成損傷，導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。

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Effects of acute cold exposure on pulmonary proinflammatory cytokine of rat

ZHANG Ying1,2， LI Xi2， ZHANG Li2， LIN Yang-sheng2， XIAO Zhong-hai2，SU Zhuang1， LIU Ying1， YANG Dan-feng2△

(1. Department of Public Health，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010059； 2. Institute of Health and Environmental Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Tianjin 300050， China)

Objective: To study the effects of acute cold exposure on the inflammation and pathologic injuries in pulmonary of rats, and explore the mechanism induced by cold stress. Methods: Forty male Wistar rats were randomly divided into five groups(n=8): control group(23±2)℃ 2.5 h, -25℃ 0.5 h group, -25℃ 1 h group, -25℃ 2 h group and -25℃ 2.5 h group. Rats were exposed to cold at -25℃and no wind by keeping them in a low temperature chamber except control group. Rectal temperatures of the rats were measured before and after cold exposure. The morphological changes of pulmonary were observed by the optics microscope. The levels of tumer necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) in lung tissue homogenate were measured by ELISA. Results: Compared to the control group, body core temperatures of the -25℃1 h group, -25℃2 h group and -25℃2.5 h group were decreased significantly, and the D-values of rectal temperature were increased before and after cold exposure (P<0.05). The infiltration of inflammatory cells and alveolar edema fluid appeared in the lung tissue of the -25℃2.5 h group. The concentrations of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) in lung tissue homogenate were increased significantly in -25℃1 h group, -25℃2 h group and -25℃2.5 h group (P<0.05). Conclusion: The infiltration of inflammatory cells and the increase in proinflammatory cytokine from pulmonary may lead to the lung tissue injury after acute cold exposure.

acute cold exposure； lung； inflammation response; rat

2011ZXJ09105-03B

2014-09-23 【修回日期】2014-11-12

R337.2

A

1000-6834(2015)01-006-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.002

△【通訊作者】Tel： 022-84655058； E-mail： fengdyd@126.com