何建華， 徐 黎， 沈 羽， 孔明建， 石林玉， 馬正良

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床學(xué)院麻醉科， 江蘇 南京 210008)

?

慢性炎性痛大鼠脊髓背角單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2表達(dá)的變化*

何建華， 徐 黎， 沈 羽， 孔明建， 石林玉， 馬正良△

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床學(xué)院麻醉科， 江蘇 南京 210008)

目的：在大鼠慢性炎性痛模型上，觀察大鼠脊髓背角單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(MCT-2)表達(dá)的變化。方法：健康雄性SD大鼠96只，體重180～220 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為2組(n=48)：生理鹽水組(NS組)和完全性弗氏佐劑組(CFA組)。CFA組左側(cè)后足足底中部皮下注射完全性弗氏佐劑(CFA)100 μl；NS組注射等量的生理鹽水。在注射前(T0)及注射后3 h(T1)、第1天(T2)、3天(T3)、5天(T4)、7天(T5)、14天(T6)和第21 天(T7)測定大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(MWT)和熱縮足反應(yīng)潛伏期(TWL)，并于上述各時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取4只大鼠，處死后取脊髓背角，采用Western blot 法測定MCT-2表達(dá)的變化。結(jié)果：CFA組大鼠在注射CFA后3 h即出現(xiàn)痛覺過敏，并持續(xù)至第14 天，其疼痛程度顯著大于NS組(P<0.05)；且T1-6時(shí)脊髓背角MCT-2與NS組相比顯著增加(P<0.05)。大鼠脊髓背角MCT-2的表達(dá)與MWT和TWL相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：慢性炎性痛大鼠脊髓MCT-2表達(dá)上調(diào)，該變化可能參與慢性炎性痛中樞敏化的形成和維持。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2；慢性炎性痛；脊髓；突觸可塑性；大鼠

慢性疼痛給患者身心造成極大的痛苦，但由于其發(fā)生機(jī)制尚未闡明，導(dǎo)致治療困難。中樞敏化是慢性疼痛的主要機(jī)制之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞參與的突觸可塑性在中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用[1，2]。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)是一類跨膜蛋白,它的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)單羧酸類物質(zhì)如乳酸、丙酮酸和酮體等進(jìn)出細(xì)胞。中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)MCT-1、MCT-2和MCT-4，其中神經(jīng)元主要表達(dá)MCT-2。新近研究發(fā)現(xiàn)，MCT在介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起關(guān)鍵作用，該轉(zhuǎn)運(yùn)過程參與了突觸長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的形成和維持[3，4]。由此可見，MCT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性中起重要作用。但是，MCT尤其是分布于神經(jīng)元上的MCT-2在慢性疼痛導(dǎo)致的中樞敏化的形成和維持過程中是否存在作用，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討慢性炎性痛大鼠脊髓背角神經(jīng)元MCT-2的變化，研究MCT-2在慢性炎性痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和模型制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD 大鼠96 只( 體重(180～220) g; 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為2組: NS組和CFA 兩大組(n=48)，每大組又分為注射前、注射后3 h、第1天、3天、5天、7天、14天和第21 天(T0、T1、T2、T3、T4、T5、T6和T7)8個(gè)亞組(n=6)。

動(dòng)物模型的制作：完全性弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant， CFA) 組：七氟醚麻醉大鼠并消毒左后肢，于其左側(cè)后足足底中部皮下注射CFA(Sigma公司 美國)100 μl；NS組左后足底中部皮下注射等量的生理鹽水。

1.2 疼痛行為學(xué)觀察

在皮下注射生理鹽水或CFA前(baseline)及注射后3 h、第1天、3天、5天、7天、14天 和第21天進(jìn)行行為學(xué)測定。所有測定均在固定時(shí)間(15∶00～18∶00)的安靜的環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.1 機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)的測定 按Chaplan 等[5]報(bào)道方法測定MWT。將大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱中，底為(0.5×0.5) cm2的鐵絲網(wǎng)。實(shí)驗(yàn)前使之適應(yīng)環(huán)境30 min。以不同折力(buckling force) 的Von Frey 纖毛( Stoelting 公司，美國) 刺激大鼠左后足底中部。從2.0 g開始，以up-down 法推測閾值，并在閾值上下各刺激5 次，使用內(nèi)推法計(jì)算出50% 反應(yīng)閾值(即引起5 次試驗(yàn)中2.5 次反應(yīng)的值) 。最大折力為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。每次實(shí)驗(yàn)至少間隔15 s，并待刺激引起的行為反應(yīng)( 如舔足等) 完全消失后再給予下一次刺激。

1.2.2 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency，TWL) 的測定 將自制的有機(jī)玻璃箱置于3 mm 厚的玻璃板上，將大鼠放入有機(jī)玻璃箱內(nèi)，使其自由活動(dòng)30 min 以適應(yīng)測試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在25℃±1.0℃。按Hargreaves 等[6]法用BME-410A 型熱痛刺激儀( 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所)照射大鼠左后足底中部稍后。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間為TWL，當(dāng)大鼠后爪移動(dòng)時(shí)，停止照射。照射自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s，以防止時(shí)間過長造成組織損傷。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，熱刺激強(qiáng)度保持相同。重復(fù)刺激5 次，每次刺激間隔2 min以上，計(jì)算時(shí)取后3 次TWL 的平均值。

1.3 Western blot 法檢測MCT-2表達(dá)

于T0-T7各時(shí)間點(diǎn)取材，每組各取4只大鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后，快速在冰面上取L4～L6 節(jié)段脊髓背角置于液氮中保存。用全蛋白提取試劑盒按操作流程提取蛋白后，應(yīng)用 BCA 法測定蛋白濃度，取20 μg 蛋白進(jìn)行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜法，轉(zhuǎn)移穩(wěn)定電流 250 mA，1.5 h可將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。TBST洗膜后，用 5% 脫脂牛奶封閉1 h，在 4℃ 條件下用1∶500 稀釋的兔抗 MCT-2抗體(英國ABcam公司)孵育過夜。洗膜后，用1∶5 000 的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體(英國ABcam公司)室溫孵育 2 h 。再次洗膜后，用 ECL 發(fā)光試劑盒在暗室內(nèi)顯像。用灰度掃描儀檢測出相應(yīng)MCT-2條帶的平均灰度值，以代表MCT-2的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 疼痛行為學(xué)測定

與NS組大鼠相比，CFA組大鼠在制模后3 h即出現(xiàn)痛覺過敏及觸誘發(fā)痛，并持續(xù)至第14 d，CFA組T1-T6時(shí)MWT及TWL降低，與NS組相比差異明顯；該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的大鼠CFA慢性炎性痛模型穩(wěn)定、可靠(P<0.05，表1、2)。

Tab. 1 Comparison of mechanical withdrawl threshold between the two groups(g， ±s, n=6)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0group

Tab. 2 Comparison of thermal withdrawl latency between the two groups(g， ±s, n=6)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0

2.2 MCT-2的表達(dá)

MCT-2在大鼠脊髓背角的表達(dá)存在相應(yīng)的改變。使用 Western blot 法測定，CFA組大鼠T1-T6各時(shí)點(diǎn)脊髓背角中MCT-2的表達(dá)顯著高于NS組(P<0.05)，各組內(nèi)參無變化。NS組各時(shí)點(diǎn)之間無變化；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠慢性炎性痛形成和維持過程中脊髓背角神經(jīng)元MCT-2的表達(dá)存在顯著的變化(圖1，表3)。

Fig.. 1 Western blot for the change of MCT-2 in CFA group

Tab. 3 Comparison of monocarboxylate transporter-2 between the two groups(±s, n=4)

CFA: Complete Freund’s adjuvant; T0-T7： Represent baseline, 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 21 d respectively

*P<0.05vsthe NS group;#P<0.05vsT0

2.3 MCT-2表達(dá)與行為學(xué)改變的關(guān)系

將NS組和CFA組所有大鼠在第 21天 處死前的疼痛行為學(xué)MWT及TWL測定值和 MCT-2的表達(dá)(Western blot 法)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示：脊髓MCT-2的表達(dá)與大鼠MWT和TWL均呈正相關(guān)(P<0.05，P<0.01)；該結(jié)果表明，慢性炎性痛大鼠脊髓背角MCT-2的表達(dá)與痛行為學(xué)的改變顯著相關(guān)。

3 討論

急、慢性炎性痛形成和維持過程中均存在痛覺敏化現(xiàn)象，因此，急慢性炎性痛脊髓背角神經(jīng)元敏化機(jī)制的研究具有重要意義[7，8]。完全性弗氏佐劑所致的大鼠慢性炎性痛模型成熟、穩(wěn)定，在以往的研究中廣泛使用。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果與先前的文獻(xiàn)報(bào)道類似，因此，本實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物模型是可靠的。

單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重要跨膜蛋白，涉及細(xì)胞的多種功能，包括胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)以及丙酮酸、乳酸等單羧酸和乙酰乙酸、β羥丁酸等酮體和甲狀腺激素等的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，目前為止已克隆出至少14個(gè)家族成員。MCT在動(dòng)物體內(nèi)分布存在明顯的組織特異性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)MCT-1、MCT-2和MCT-4，其中神經(jīng)元主要表達(dá)MCT-2，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MCT-1和MCT-4。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的糖原儲存細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元乳酸穿梭機(jī)制表明，神經(jīng)元活動(dòng)期間不僅通過葡萄糖直接獲得能量供給，同時(shí)神經(jīng)元還通過星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞上的MCT-1和MCT-4釋放乳酸，神經(jīng)元表面的MCT-2攝取膠質(zhì)細(xì)胞中釋放的乳酸也作為其主要能量代謝底物[9]。由此可見，MCT在神經(jīng)系統(tǒng)的能量供應(yīng)中發(fā)揮十分重要的作用。

近來Pierre J. Magistretti等[3]研究發(fā)現(xiàn)，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸在長時(shí)程記憶形成中發(fā)揮重要作用。他們通過訓(xùn)練大鼠學(xué)習(xí)記憶逃避反應(yīng)的同時(shí)運(yùn)用在體微透析技術(shù)監(jiān)測海馬乳酸濃度，發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練后大鼠海馬局部乳酸濃度升高，而預(yù)先定位注射糖原磷酸化酶抑制劑DAB和α糖苷酶抑制劑未升高，定位注射反義寡核苷酸敲除MCT-1、MCT-2和MCT-4能抑制大鼠海馬MCT表達(dá)，阻斷逃避反應(yīng)記憶的形成。同時(shí)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制MCT的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)能消除海馬L-LTP的形成和維持，而對短時(shí)記憶無效[3]。由此可見，MCT在介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)，參與神經(jīng)元突觸可塑性，尤其是長期改變方面發(fā)揮重要作用。

神經(jīng)元突觸可塑性是中樞敏化的主要機(jī)制之一，LTP是中樞敏化機(jī)制重要的表現(xiàn)形式。本研究結(jié)果表明，在慢性炎性痛的形成和維持過程中，作為疼痛調(diào)控重要中樞的脊髓背角MCT-2表達(dá)明顯上調(diào)，其升高幅度與大鼠的痛行為明顯相關(guān)，由此提示，MCT-2可能參與慢性炎性痛脊髓背角的敏化過程。由于MCT在LTP形成和維持中的重要作用，因此我們推測，脊髓背角神經(jīng)元上MCT-2可能通過影響脊髓背角神經(jīng)元LTP參與了慢性炎性疼痛所致的脊髓中樞敏化過程。同時(shí)，脊髓背角神經(jīng)元上MCT-2參與疼痛也可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管膜上的MCT-1和MCT-4有關(guān)。由此，脊髓MCT-2的改變有可能成為我們尋求治療慢性炎性疼痛導(dǎo)致的中樞敏化的靶點(diǎn)之一。

關(guān)于脊髓背角神經(jīng)元MCT-2參與慢性炎性疼痛的可能機(jī)制，推測在慢性炎性疼痛的持續(xù)刺激下，脊髓背角神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，能量需求增加，其通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)相關(guān)基因進(jìn)而調(diào)控MCT-2蛋白表達(dá)增加，增加向胞內(nèi)運(yùn)送乳酸，滿足神經(jīng)細(xì)胞的能量需求。同時(shí)，長時(shí)間的神經(jīng)元興奮所致的MCT-2的表達(dá)增強(qiáng)，有可能通過激活胞內(nèi)的CREB、Arc及Cofilin等有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)中樞敏化病理過程的發(fā)生和發(fā)展[10-12]。當(dāng)然，本研究結(jié)果只是初步表明了脊髓背角神經(jīng)元MCT-2可能參與了慢性炎性疼痛的形成和維持，關(guān)于其參與復(fù)雜的慢性疼痛進(jìn)程的可能機(jī)制以及在其他急慢性疼痛過程中有何作用還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢性炎性痛大鼠脊髓背角MCT-2表達(dá)水平明顯升高，其升高幅度與大鼠痛敏行為學(xué)變化明顯相關(guān)，其可能參與慢性炎性痛大鼠脊髓水平中樞敏化的調(diào)控。

[1] Adolph O, Josef Fohr K. Targeting spinal long-term potentiation as a basis for anlagesia: recent developments[J].CurrClinPharmacol, 2012, 7(1): 1-6

[2] Ruscheweyh R, Wilder-Smith O, Drdla R,etal. Long-term potentiation in spinal nociceptive pathways as a novel target for pain therapy[J].MolPain, 2011, 7(1): 20.

[3] Suzuki A, Stern SA, Bozagi O，etal. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation[J].Cell， 2011， 144(5): 810-823.

[4] Newman LA, Korol DL, Gold PE. Lactate produced by glycogenolysis in astrocytes regulates memory processing[J].PLoSOne， 2011， 6(12): e28427.

[5] Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW，etal． Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw [J].JNeurosciMethods, 1994, 53(1): 55-63.

[6] Hargreaves K， Dubner R， Brown F，etal． A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia [J].Pain, 1988, 32(1): 77-88.

[7] 褚賽純, 胡玉燕, 李清君， 等. NOS 抑制劑對甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠痛反應(yīng)及脊髓神經(jīng)元凋亡的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2011, 27(3): 372-375.

[8] 吳黃輝， 尹俊濱， 陳 宇， 等. 鞘內(nèi)應(yīng)用右美托咪定改善完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的大鼠慢性炎性痛行為及其機(jī)制研究[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2014， 30(2): 159-166.

[9] Rae C, Fekete AD, Kashem MA,etal. Metabolism, compartmentation, transport and production of acetate in the cortical brain tissue slice[J].NeurochemRes， 2012， 37(11): 2541-53.

[10]Descalzi G, Fukushima H, Suzuki A,etal. Genetic enhancement of neuropathic and inflammatory pain by forebrain up regulation of CREB-mediated transcription[J].MolPain， 2012, 8(1): 90.

[11]Hossaini M, Jongen JL, Biesheuvel K,etal. Nociceptive stimulation induces expression of Arc/Arg3.1 in the spinal cord with a preference for neurons containing enkephalin[J].MolPain, 2010, 6(1): 43.

[12]Zulauf L, Coste O, Marian C,etal. Cofilin phosphorylation is involved in nitric oxide/cGMP-mediated nociception[J].BiochemBiophysResCommun， 2009, 390(4): 1408-1413.

The changes of monocarboxylate transporter-2 in spinal cord horn in a rat model of chronic inflammatory pain

HE Jian-hua, XU li, SHEN Yu, KONG Ming-jian, SHI Lin-yu, MA Zheng-liang△

(Department of Anesthesiology, the Affiliate Drum Tower Clinical College of Nanjing Medical University, Nanjing 210008， China)

Objective: To investigate the changes in the levels of monocarboxylate transporter-2 in spinal cord horn in a rat model of chronic inflammatory pain. Methods: Male SD rats weighting 180～220 g were randomly divided into two groups(n=48): normal saline group (NS group), complete Freund’s adjuvant group (CFA group). Rats were given injections of CFA 100 μl in left hind paw in group CFA, and an equal volume of saline was given injection in group NS. Mechanical withdraw threshold(MWT) and thermal withdraw latency(TWL) were measured at before injection(T0) and 3 h, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, and 21 d after injection(T1-7). Four rats were chosen from each group at T0-7and sacrificed, and L4-5 segments of the spinal cord horn were removed for measurement of the expression of monocarboxylate transporter-2 by Western blot analysis. Results: In CFA group, mechanical hyperalgesia and allodynia appeared on the 3 h after CFA injection, then until the day 14. The expression of monocarboxylate transporter-2 in the spinal dorsal horn of rats in CFA group was significantly higher than that in normal control group at T1-6(P<0.05). The protein level of monocarboxylate transporter-2 was apparently correlated with MWT and TWL(P<0.01 andP<0.05) in CFA group. Conclusion: The level of monocarboxylate transporter-2 in spinal dorsal horn is significantly increased in a rat model of chronic inflammatory pain and the change may involve in the formation and maintenance of central sensitization in spinal cord of chronic inflammatory pain.

monocarboxylate transporter-2； chronic inflammatory pain; spinal cord； synaptic plasticity； rats

國家自然基金資助項(xiàng)目(81070892,81171048)；江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(XK201140)

2014-07-08 【修回日期】2014-10-24

R73-3

A

1000-6834(2015)01-019-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.007

△【通訊作者】Tel： 025-83105502； E-mail: mazhengliang1964@nju.edu.cn