馮利杰，張 瑾，丁 倩，朱 娜，王 鵬，沈玉君，沈玉先

(安徽醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院，2.藥學院，3.生物藥物研究所，安徽 合肥 230032)

自噬參與神經(jīng)細胞中過表達tau和異常磷酸化tau蛋白的降解

馮利杰1，3，張 瑾2，3，丁 倩1，3，朱 娜2，3，王 鵬2，3，沈玉君3，沈玉先1，3

(安徽醫(yī)科大學 1.基礎醫(yī)學院，2.藥學院，3.生物藥物研究所，安徽 合肥 230032)

目的 觀察自噬對神經(jīng)細胞內(nèi)源性tau、過表達tau和異常磷酸化tau蛋白水平的影響，探討不同形式tau蛋白降解的可能機制。方法 體外培養(yǎng)小鼠神經(jīng)瘤母細胞株N2a和敲除Atg5基因的小鼠胚胎成纖維細胞株MEF，分別轉(zhuǎn)染GFP-tau質(zhì)粒，并用蛋白磷酸酯酶抑制劑岡田酸(okadaic acid, OA)誘導tau蛋白過度磷酸化，自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)和溶酶體抑制劑氯化銨(NH4Cl)處理細胞，Western blot法檢測tau、磷酸化tau以及自噬相關蛋白LC3和p62的表達；放線菌酮 (cycloheximide, CHX) 示蹤法觀察tau和磷酸化tau的降解；GFP-tau和RFP-Lamp1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細胞，觀察tau和溶酶體的定位；免疫熒光染色和DAB染色觀察自噬抑制對表達tau細胞形態(tài)的影響。結果 與溶媒對照組相比，NH4Cl和rapamycin處理組細胞內(nèi)源性tau蛋白水平無明顯變化；過表達tau的細胞中，NH4Cl能增加tau和OA誘導的磷酸化tau蛋白水平，而rapamycin處理組細胞中tau和磷酸化tau水平降低，尤其是高分子量的磷酸化tau寡聚體明顯減少；CHX實驗證明自噬抑制能減緩tau和磷酸化tau的降解；tau和溶酶體在細胞內(nèi)存在共定位；過表達tau的N2a細胞經(jīng)NH4Cl處理后，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量tau聚集體，細胞核變小、固縮甚至消失。結論 自噬參與神經(jīng)細胞中過表達tau和異常磷酸化tau蛋白的降解，抑制自噬能增加tau的細胞毒作用。

阿爾茨海默病;tau；磷酸化；自噬；蛋白降解；細胞毒性

Tau 蛋白是一種微管相關蛋白，主要分布在神經(jīng)元，其功能是與微管蛋白結合，促進微管的形成并保持其穩(wěn)定性，對維持神經(jīng)細胞骨架完整性和正常軸突運輸起著重要的作用。在病理狀態(tài)下，tau 被高度磷酸化失去結合微管的能力，聚集并形成成對螺旋絲(paired helical filament, PHF)，從而導致細胞骨架異常及細胞死亡。因此，PHF-tau 組成的神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)被認為是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的病理性標記物之一，也廣泛存在于其他神經(jīng)退行性疾病中[1]。國際學術界將這類有異常tau蛋白聚集的神經(jīng)變性疾病稱之為tau蛋白病[2]。神經(jīng)細胞內(nèi)非正常狀態(tài)tau蛋白的存在，無論是tau不溶性的聚集體、還是可溶性的寡聚體，無論是修飾的還是未修飾的(如磷酸化和非磷酸化)，都可能影響細胞的功能狀態(tài)[3]。因此，增加細胞內(nèi)非正常狀態(tài)tau蛋白的降解，可能是抑制tau的毒性和保護神經(jīng)元的有效策略之一。

細胞自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種高度保守的溶酶體依賴性的降解程序。在營養(yǎng)缺乏、應激等條件下，它可以通過降解細胞內(nèi)長壽命蛋白質(zhì)和細胞器，獲得必需的氨基酸、脂肪酸、核酸等營養(yǎng)物質(zhì)，有利于維持細胞自我穩(wěn)態(tài)，促進細胞生存[4]。因此，自噬在細胞發(fā)育、細胞免疫、組織重塑、以及環(huán)境適應等方面起著十分重要的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)自噬功能缺陷與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而這些疾病的顯著特點就是大腦神經(jīng)元內(nèi)蛋白的異常聚集。因此通過自噬清除神經(jīng)元內(nèi)異常聚積的蛋白，維持神經(jīng)元正常功能顯得尤為重要。臨床上對AD病人腦皮層活檢標本進行研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)自噬小體顯著增加[5-6]；敲除自噬相關基因Atg5/Atg7的大鼠出現(xiàn)典型的神經(jīng)元退化[6-7]，提示自噬在神經(jīng)退行性疾病中可能扮演了極為重要的角色。目前自噬參與tau降解的研究很多，但對于不同形式tau蛋白是否通過自噬降解還存在著爭議。有研究認為磷酸化tau的聚集體傾向于自噬降解，蛋白酶體主要降解可溶性tau；也有研究發(fā)現(xiàn)不論是可溶的還是不可溶的tau都可以通過自噬降解[8-9]。為了更好地了解自噬在tau蛋白降解中的作用，我們采用表達內(nèi)源性tau的神經(jīng)細胞，建立過表達tau或tau過度磷酸化的細胞模型，觀察自噬對神經(jīng)細胞內(nèi)不同形式tau蛋白降解的影響；同時觀察自噬抑制對tau細胞毒性的影響，為全面了解tau蛋白的降解機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及抗體Atg5基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞株(Atg5-/-MEFs)受贈于中科院生物物理所張宏教授；表達紅色熒光蛋白的Lamp1-RFP重組質(zhì)粒受贈于美國馬里蘭大學方圣云教授；pEGFP-C1-tau真核表達質(zhì)粒由本實驗室構建[10]，DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM和EBSS培養(yǎng)液購自Gibco公司；lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；小牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自Pierce公司，溶酶體抑制劑氯化氨(NH4Cl)購自上海生工，自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin)購自Santa Cruz，岡田酸(okadaic acid, OA)和放線菌酮(cycloheximide, CHX)購自Sigma公司，tau-5單克隆抗體購于Biosourse公司，AT-8單克隆抗體購自Pierce公司，LC3、p62、GAPDH和α-tubulin多克隆抗體購自Sigma公司，GFP抗體購于Abmart公司，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L)和Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG(H+L)購自Invitrogen公司，DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 小鼠神經(jīng)瘤母細胞株N2a培養(yǎng)于含10%小牛血清、105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。轉(zhuǎn)染前取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化后重新接種于6孔板中，細胞密度為3～5×105個/孔。待細胞生長至60%～70%匯合后，采用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，操作方法參照轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h，熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，通過計算5個視野表達綠色熒光的細胞數(shù)和總細胞數(shù)比值作為轉(zhuǎn)染陽性率，pEGFP-C1空載體和pEGFP-C1-tau的轉(zhuǎn)染效率分別為(87.0±4.1)%、(75.0±2.3)%。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡 轉(zhuǎn)染后24 h，培養(yǎng)液中加入終濃度為10 nmol·L-1的OA處理細胞12 h，對照組加入等體積的溶媒二甲基亞砜(DMSO)，用含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液冰上裂解細胞30 min，100 ℃變性10 min，SDS-PAGE膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含0.5 g·L-1脫脂奶粉和0.05%吐溫20的PBS(PBST)封閉30 min后，加入適當稀釋度的一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗10 min×3次，加入適當稀釋度的二抗，室溫結合2 h，PBST洗10 min×3次，ECL顯影。掃描以后用Photoshop CS軟件進行分析。

1.2.3 CHX示蹤實驗 MEFs細胞轉(zhuǎn)染GFP-tau，轉(zhuǎn)染后24 h加入OA處理12 h誘導tau蛋白磷酸化，全量更換為EBSS培養(yǎng)液誘導細胞自噬，同時加入CHX(100 mg·L-1)抑制細胞蛋白質(zhì)合成，分別于EBSS孵育0、3、6和9 h收集細胞進行裂解，蛋白免疫印跡方法同前。

1.2.4 細胞免疫熒光染色和DAB染色 接種于24孔板的細胞去除培養(yǎng)液，4 %多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS洗5 min×3次，用含1.0 g·L-1牛血清白蛋白和1.0 g·L-1皂素的PBS于4 ℃透膜封閉處理0.5 h，加入一抗37 ℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，依次加SP試劑盒中的B和C液，DAB顯色；PBS洗5 min×3次后加入適當稀釋度的一抗37 ℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，加入適當稀釋度的熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，DAPI (5 mg·L-1)孵育10 min襯染核，PBS洗5 min×3次，共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡采集圖片。

2 結果

2.1 自噬對N2a細胞內(nèi)源性tau水平的影響自噬激活劑rapamycin(10 mg·L-1)或溶酶體抑制劑NH4Cl(25 mmol·L-1)處理N2a細胞6 h，tau-5抗體檢測內(nèi)源性tau蛋白水平，并以微管相關蛋白1輕鏈 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和自噬底物蛋白p62的變化作為檢測細胞自噬水平的指標。結果如Fig 1A所示，NH4Cl處理組LC3 Ⅱ型與 Ⅰ型的比例顯著增加，同時p62水平升高，提示細胞自噬抑制；而rapamycin處理組LC3 Ⅱ型與Ⅰ型的比例增加，伴有p62減少，提示細胞自噬激活；與溶媒對照組相比，NH4Cl或rapamycin處理組細胞內(nèi)源性tau水平無明顯變化，提示自噬不參與內(nèi)源性tau的降解。

2.2 自噬對N2a細胞中過表達tau水平影響N2a細胞分別轉(zhuǎn)染GFP-vector和GFP-tau質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24 h，同上采用rapamycin和NH4Cl處理細胞6 h后檢測細胞內(nèi)GFP-tau蛋白水平。結果發(fā)現(xiàn)，與溶媒對照組相比，NH4Cl處理組細胞GFP-tau表達升高，而rapamycin處理后GFP-tau水平明顯降低(Fig 1B，D)，提示自噬降低神經(jīng)細胞內(nèi)過表達tau的水平。

2.3 自噬對N2a細胞中磷酸化tau水平的影響同上轉(zhuǎn)染細胞，用OA(10 nmol·L-1)處理細胞12 h誘導tau過度磷酸化，同上加入rapamycin或NH4Cl處理細胞6 h，分別采用AT-8和tau-5抗體檢測細胞內(nèi)磷酸化tau和總tau蛋白水平。結果如Fig 1C和E所示，NH4Cl處理組細胞中總tau水平明顯上調(diào)，AT-8抗體識別的Ser202/Thr205位點磷酸化tau蛋白水平增加；而rapamycin 處理組細胞中磷酸化tau形成的高分子量寡聚體(150 kd左右)明顯減少[11](Fig 1C箭頭所示)。提示自噬降低神經(jīng)細胞內(nèi)磷酸化tau蛋白的水平，尤其是磷酸化tau寡聚體水平。

Fig 1 Effect of autophagy on levels of tau and hyperphosphorylated tau in Neuro2A cells

A: The levels of endogenous tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; B: The levels of overexpressed tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; C: The levels of hyperphosphorylated tau in NH4Cl or rapamycin treated cells; D: The quantitative analyses for tau proteins of the results in panel B. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments; E: For quantitative analyses of the results in panel C, the bands around molecular mass of 79 kDa for phosphorylated tau and 150kDa for tau oligomers were included. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.4 自噬參與tau和磷酸化tau的降解為了進一步明確tau蛋白水平的降低是由于降解增加所致，我們采用CHX示蹤實驗觀察tau的降解情況。結果如Fig 2所示，隨著饑餓誘導自噬時間的延長，正常MEFs組細胞中tau水平逐漸降低，而自噬功能缺陷的Atg5-/-MEFs細胞中，tau降解速度明顯減慢。提示自噬參與tau的降解。同上轉(zhuǎn)染MEFs細胞后，加入OA處理12 h誘導tau蛋白磷酸化，結果顯示，隨著饑餓誘導自噬時間的延長，正常MEFs細胞中磷酸化tau水平逐漸降低；而Atg5-/-MEFs細胞中磷酸化tau蛋白的降解速度明顯減慢(Fig 3)。提示自噬參與磷酸化tau的降解。

2.5 N2a細胞中tau和溶酶體的共定位N2a細胞轉(zhuǎn)染GFP-tau和RFP-Lamp1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24 h，加入OA誘導tau過度磷酸化，NH4Cl處理細胞6 h后觀察細胞內(nèi)tau和溶酶體的定位情況。結果顯示，tau蛋白和Lamp1存在共定位，磷酸化tau形成的聚集體和Lamp1的共定位增加；提示tau和磷酸化tau能進入溶酶體降解(Fig 4箭頭所示)。

2.6 自噬抑制對細胞形態(tài)的影響為了觀察自噬抑制對過度表達tau細胞形態(tài)的影響，我們同上轉(zhuǎn)染N2a細胞，NH4Cl處理細胞6 h，用DAB結合免疫熒光染色法檢測細胞形態(tài)以及tau和LC3的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，少量表達tau的細胞形態(tài)基本正常，細胞核完整(Fig 5，細箭頭所示)；而tau表達量多的細胞胞體變圓，突起減少或消失(Fig 5，粗箭頭所示)；經(jīng)NH4Cl處理后，細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)LC3點狀聚集；表達tau細胞中tau形成聚集體，細胞核變小、致密或淡染、碎裂甚至消失(Fig 5，空箭頭所示)。提示自噬抑制能增加tau的細胞毒性。

Fig 2 Autophagy facilitates tau degradation in MEF cells

A: Tau transfected MEF cells were starved in EBSS for the indicated times, and the levels of tau were blotted by tau-5 antibody; B: The quantitative data of the results in panel A. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01vsAtg5+/+MEFs.

Fig 3 Autophagy facilitates phosphorylated tau degradation in MEF cells

A: Tau transfected MEF cells were grown for 24 hrs and treated with OA for 12 hrs, and then starved in EBSS for the indicated times, phosphorylated tau levels were blotted by AT-8 antibody; B: The quantitative data of the results in panel A. Values are expressed as mean ± SEM of three independent experiments.*P<0.05vsAtg5+/+MEFs.

3 討論

Fig 4 Colocalization of tau and lysosome in Neuro2A cells

Neuro2A cells were transfected with GFP-tau and RFP-lamp1 plasmids. Twenty-four hours after transfection cells were treated or not with OA for 12 hrs, and then treated with NH4Cl for 6 hrs. The typical colocalization of tau and lysosome was indicated by arrows. Scale bar=5 μm.

Fig 5 Autophagy inhibition increases tau toxicity

Neuro2A cells were transfected with tau, and then treated with NH4Cl for 6 hrs, cell morphology and LC3 expression were observed with DAB and immunofluorescence stain respectively. BF: Bright field. Scale bar=20 μm.

正常tau蛋白是一種含磷蛋白質(zhì)，每克分子tau蛋白中磷酸含量為2～3 mol。AD患者腦中tau蛋白發(fā)生過度磷酸化，每克分子tau中磷酸含量為5～9 mol。過度磷酸化tau蛋白聚集形成PHFs，除了失去促進微管組裝的功能外，還能促使正常微管結構中已結合的tau蛋白解離出來，從而導致細胞骨架的崩解，引起神經(jīng)元死亡。因此，PHF-tau組成的NFTs被認為是AD的病理性標志物之一，也廣泛地存在于其他的神經(jīng)退行性疾病中。Tau蛋白的磷酸化水平受細胞內(nèi)蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的雙重調(diào)節(jié)，該平衡失調(diào)是tau發(fā)生異常磷酸化的主要原因。因此，任何引起蛋白激酶活性上調(diào)或磷酸酯酶活性下降的因素都可能導致tau的異常磷酸化。哺乳動物中磷酸酯酶主要有4種：PP-1、PP-2A、PP-2B和PP-2C。研究發(fā)現(xiàn)AD腦中PP-1、PP-2A等活性降低，對tau蛋白去磷酸化作用減弱，導致tau的磷酸化增加[12]。 OA是一種選擇性蛋白磷酸酯酶PP1和PP2A的抑制劑，目前被廣泛應用于誘導tau蛋白的過度磷酸化，模擬AD患者大腦中tau蛋白的異常磷酸化改變[12]。OA能導致Ser199、Ser202、Thr205、Ser396和Ser404等多個位點的磷酸化，其中，Ser202/Thr205位點過度磷酸化是tau蛋白病的共同特征，可在AD大腦NFTs中檢測到[13]；因此，在本研究中我們用OA來誘導tau蛋白過度磷酸化，采用特異性識別Ser202/Thr205位點磷酸化tau蛋白的單克隆抗體AT-8來進行蛋白檢測[11]。有研究發(fā)現(xiàn)Ser202/Thr205位點過度磷酸化能促進tau寡聚化，從而加劇神經(jīng)退行性變的進程[14]，本研究中我們同樣發(fā)現(xiàn)用OA誘導N2a細胞tau蛋白過度磷酸化后，高分子量的tau寡聚體增加。

為了探究自噬對細胞內(nèi)tau和磷酸化tau水平的影響，我們采用溶酶體抑制劑或自噬激活劑處理N2a細胞，觀察LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、p62以及tau蛋白表達變化。LC3是自噬體膜標志性蛋白，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種亞型；自噬形成時，胞質(zhì)型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反映自噬水平的高低[15]。但在溶酶體功能抑制的情況下，LC3-Ⅱ自噬降解減少，同樣會導致LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，因此我們同時檢測了自噬底物蛋白p62的水平；p62能與泛素修飾的底物蛋白結合，并與自噬體膜上的LC3結合，從而介導泛素化底物和自身通過溶酶體降解，因此p62水平在一定程度上反映了細胞自噬活性[16]；我們的結果顯示rapamycin處理的細胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62水平降低；而NH4Cl處理的細胞，由于LC3-Ⅱ的溶酶體降解受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，同時p62水平增加，提示本實驗中rapamycin和NH4Cl能有效調(diào)節(jié)自噬活性；在此基礎上，我們首先觀察了自噬對神經(jīng)細胞內(nèi)源性tau表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)自噬激活或抑制對內(nèi)源性tau水平無明顯影響，提示自噬不參與神經(jīng)細胞內(nèi)源性tau降解。而在過表達tau的N2a細胞中，rapamycin能明顯降低tau水平，尤其是減少磷酸化tau寡聚體水平；而NH4Cl處理后tau和磷酸化tau水平增加，提示自噬能降低過表達tau，尤其是磷酸化tau寡聚體水平。

通常情況下，細胞自噬的發(fā)生依賴于一系列自噬相關基因(autophagy related gene，Atg)編碼的蛋白，這些蛋白在自噬的不同階段發(fā)揮著重要的作用。其中Atg5在細胞內(nèi)形成Atg12-Atg5復合物，能促使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，對自噬體膜的延伸至關重要[17]。因此，Atg敲除通常代表細胞喪失自噬能力。Atg5基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(Atg5-/-MEFs細胞)作為特異性自噬缺失細胞，和野生型MEFs細胞一起作為研究對象，能更直觀地反映自噬對tau降解的影響。因此，我們在饑餓誘導細胞自噬的基礎上觀察兩種MEFs細胞中tau和磷酸化tau的降解情況，結果發(fā)現(xiàn)自噬缺失的細胞中tau和磷酸化tau降解速率明顯降低，提示自噬能促進tau和磷酸化tau的降解。

溶酶體是細胞自噬的關鍵細胞器。細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和細胞器最終在溶酶體降解。為了觀察tau是否經(jīng)過溶酶體途徑降解，我們共轉(zhuǎn)染GFP-tau和表達溶酶體相關膜蛋白的質(zhì)粒RFP-Lamp1，結果發(fā)現(xiàn)tau和Lamp1在胞質(zhì)內(nèi)存在共定位，異常磷酸化tau形成的tau聚集體與溶酶體的共定位更明顯，進一步證實tau和磷酸化tau通過溶酶體降解。另外，我們發(fā)現(xiàn)少量表達tau的細胞形態(tài)基本正常；而tau表達較多的細胞形態(tài)異常，胞體變圓，突起減少或消失，這與我們前期結果一致[18]；而自噬抑制能加重tau的毒性作用，表達tau細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)tau聚集體，細胞核分葉、固縮、碎裂或消失。

綜上所述，細胞自噬參與過表達tau和異常磷酸化tau的降解，降低磷酸化tau寡聚體水平，而對內(nèi)源性tau水平無明顯影響；自噬抑制能增加tau的細胞毒性。至于自噬通路如何參與tau和磷酸化tau的降解過程，以及自噬減少tau寡聚體的具體機制還需進一步的研究。

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Autophagy involved in overexpressed tau and okadaic acid-induced hyperphosphorylated tau degradation

FENG Li-jie1,3,ZHANG Jin2,3,DING Qian1,3,ZHU Na2,3,WANG Peng2,3,SHEN Yu-jun3,SHEN Yu-xian1,3

(1.SchoolofBasicMedicalSciences, 2.SchoolofPharmacy, 3.InstituteofBiopharmaceuticalResearch,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001)

Aim To observe the effect of autophagy on the levels of endogenous tau, overexpressed tau and hyperphosphorylated tau induced by okadaic acid (OA) in Neuro2A cells. On this basis we are supposed to explore the role of autophagy in tau degradation. Methods Neuro2A and Atg5 knockdown(Atg5-/-)MEFs cells were cultured and transfected with GFP-tau plasmid, and equal amount of empty vector was used as control. Twenty-four hours after transfection, cells were incubated with or without OA for 12 h, followed by treated with a lysosome inhibitor NH4Cl or an autophagy inducer rapamycin for 6 h, and the levels of tau, phosphorylated tau, LC3 and p62 were detected by Western blot. The cycloheximide (CHX) chase analysis was employed to determine tau or phosphorylated tau degradation. Meanwhile, expression and intracellular localization of tau and lamp1 in Neuro2A cells were observed under confocal microscopy. Immunohistochemistry was used to observe the morphology of tau-positive cells. Results Our study showed that autophagy activation or inhibition had no influence on the levels of endogenous tau. On the contrary, the levels of tau and phosphorylated tau were increased in tau-transfected Neuro2A cells treated with NH4Cl, which was reversed on induction of autophagy by rapamycin, especially high molecular weight polymer tau. CHX chase results showed that the clearance of tau and phosphorylated tau were delayed in Atg5-/-MEF cells. GFP-tau and RFP-Lamp1 were colocalized in Neuro2A cells. Furthermore, NH4Cl treatment significantly facilitated tau aggregation and increased tau cytotoxicity.Conclusion Autophagy is involved in overexpressed tau and OA-induced hyperphosphorylated tau degradation, whereas it is not involved in endogenous tau degradation.Inhibition of autophagy enhances tau aggregation and cytotoxicity.

tau；phosphorylation；autophagy；protein degradation；cytotoxicity;Alzheimer’s disease

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.013.html

2014-12-04,

2015-01-04

國家自然科學基金(No 81302755)；安徽省教育廳重點項目(No KJ2013A159)；高等學校博士學科點專項科研基金(No 20123420120002)

馮利杰(1980-)，女，博士，講師，E-mail：fenglijie1128@sina.com； 沈玉先(1965- )，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：功能性蛋白與藥物作用靶點，Tel：0551-65113750，E-mail：shenyx@ustc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.013

A

1001-1978(2015)03-0356-07

R-332；R329.24；R341；R745.7