趙秀紅，夏媛媛，黃玉榮，張愛杰，魏廣力，司端運

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院,天津 300070;2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193)

LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中布洛芬對映體的濃度

趙秀紅1,2，夏媛媛2，黃玉榮2，張愛杰2，魏廣力2，司端運2

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院,天津 300070;2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193)

目的 建立簡便、快速、靈敏的LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中手性藥物布洛芬濃度的分析方法，進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，并用于布洛芬在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。方法 以酮洛芬為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品經(jīng)正己烷(含5%異丙醇)液萃取后，以甲醇: 1 mmol·L-1甲酸銨(含0.2%甲酸，10%甲醇)(82 ∶18，V/V)為流動相，采用Lux 5u Cellulose-3(250 mm·4.6 mm，5 μm)柱分離，流速為0.8 mL·min-1。通過電噴霧電離源以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進(jìn)行負(fù)離子檢測，用于定量分析的離子對分別為m/z205.2/161.2(布洛芬)和m/z253.1/209.2(內(nèi)標(biāo)，酮洛芬)。方法驗證包括基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、線性、定量下限、批內(nèi)與批間精密度、穩(wěn)定性、稀釋效應(yīng)等。結(jié)果 犬血漿中左/右旋布洛芬的線性范圍為0.2～50 mg·L-1，最低定量限為0.2 mg·L-1，批內(nèi)、批間精密度(RSD)介于1.01%～13.1%之間。Beagle犬單次口服給予右旋布洛芬后的主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax、T1/2、AUC(0-t)分別為：( 82.98±14.83 ) mg·L-1、( 3.217±0.7298) h、( 362.0±58.67 ) h·mg·L-1。單次口服給予消旋布洛芬后，其左/右旋布洛芬的主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax、T1/2、AUC(0-t)分別為：(70.62±14.81)/(74.48±20.08) mg·L-1、(1.520±0.9286)/(5.432±1.234) h、(177.8±34.18)/(649.6±200.2) h·mg·L-1。結(jié)論 該方法簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好，能夠同時測量血漿中左/右旋布洛芬的藥物濃度，可用于布洛芬在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。

布洛芬;LC-MS/MS;血藥濃度; Beagle犬;藥代動力學(xué)；對映異構(gòu)體

布洛芬為芳基丙酸類非甾體抗炎藥(NSAIDs)，是目前臨床上應(yīng)用廣泛的抗炎鎮(zhèn)痛藥物[1]，通過抑制前列腺素的合成而達(dá)到解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用[2]。布洛芬化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個手性碳，因此有一對對映異構(gòu)體，通常以外消旋體的形式存在，其中左旋體 (R構(gòu)型) 與右旋體 (S構(gòu)型) 的比例為1 ∶1[3]。右旋布洛芬( dexibuprofen ) 作為布洛芬優(yōu)勢異構(gòu)體，在體外比左旋布洛芬 (低活性異構(gòu)體) 表現(xiàn)出更好的藥理活性，其活性比為160 (優(yōu)勢異構(gòu)體/低活性異構(gòu)體)[3-4]。其中，右旋布洛芬藥理活性是臨床常用外消旋體活性的1.6倍[5]，制藥企業(yè)正在開發(fā)單獨的右旋口服和注射制劑。據(jù)文獻(xiàn)報道[3,6-7]，體內(nèi)存在的異構(gòu)化酶可將左旋布洛芬單向轉(zhuǎn)化為右旋布洛芬，為了考察左/右旋布洛芬在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，有必要建立能夠同時測定左/右旋布洛芬的簡便、快速、靈敏的方法。宮愛申等[1]建立了HPLC-UV法測定Beagle犬血漿中右旋布洛芬濃度的方法，但該方法并不能應(yīng)用于消旋布洛芬兩個對映體的同時測定，不能進(jìn)一步研究左/右旋布洛芬在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化。Sharma等[8]采用衍生化法測定了人血漿中的手性布洛芬，但是該方法操作復(fù)雜，對于批量生物樣品的測定，分析周期長、效率低。本研究擬建立能夠同時測定犬血漿中左/右旋布洛芬的定量分析方法，與文獻(xiàn)報道的方法相比，該方法簡便、靈敏、高效，并將其應(yīng)用于Beagle犬單獨給予右旋布洛芬和消旋布洛芬后體內(nèi)的血藥濃度的測定，可以為考察左/右旋布洛芬的單向轉(zhuǎn)化及布洛芬在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 藥品：消旋布洛芬(純度98.8%，批號100179-201105)、酮洛芬(純度99.9%，批號100337-201104)，均購于中國食品藥品檢定研究院；左旋布洛芬(純度100%，批號5-JGC-193-1)、右旋布洛芬(純度>98%，批號51146-56-6)，均購于加拿大Toronto研究化學(xué)總公司；布洛芬片(0.2 g/片，批號130151)，購于濟(jì)南永寧制藥股份有限公司；右旋布洛芬片(0.2 g/片，批號1305003)，購于江西匯仁藥業(yè)有限公司。

試劑：甲醇，色譜純，Thermo Fisher公司；甲酸，色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；正己烷和異丙醇，均為色譜純，天津市康科德科技有限公司；磷酸，優(yōu)級純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器 日本Shimadzu公司Prominence 30A液相色譜儀，配有LC-30AD二元梯度泵，CTO-30A柱溫箱，SIL-30AC自動進(jìn)樣器，DGU-20A5脫氣機；美國Applied Biosystems公司Sciex TRIPLE QUADTM5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)及Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理軟件；XS105型分析天平，瑞士METTER TOLEDO公司；Sorvall Legend Micro 17R臺式高速冷凍離心機，Thermo Scientific公司；3K15型高速冷凍離心機，Sigma公司；TARGINTMVX-Ⅱ型多管渦旋振蕩器，北京踏錦科技有限公司；Turbo Vap LV型樣品濃縮儀，美國Caliper公司。

1.1.3 動物 Beagle犬6只，普通級，♀♂各半，體質(zhì)量(10.12±0.5868) kg，北京瑪斯生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2011-0003；質(zhì)量合格證明：11400600000228。本研究在天津市新藥安全評價研究中心動物實驗設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，動物實驗已經(jīng)獲取天津市新藥安全評價研究中心IACUC的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：2014042104。

1.2 方法

1.2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件:色譜柱：Lux 5u Cellulose-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱Guard Cartridge Kit，美國菲羅門公司；柱溫：27°C；流動相：甲醇：1 mmol·L-1甲酸銨(含0.2%甲酸，10%甲醇)= 82:18；流速：0.8 mL·min-1；保留時間：左旋布洛芬8.68 min、右旋布洛芬9.66 min、內(nèi)標(biāo)酮洛芬8.56 min；儀器運行時間：15 min(7.5 min～11.0 min切換進(jìn)入質(zhì)譜)。

質(zhì)譜條件：離子化源：電噴霧離子源，負(fù)離子檢測；噴霧電壓(IS)：-4 500 V；源溫度(TEM)：550 ℃；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；定量檢測：布洛芬m/z205.2/161.2，酮洛芬m/z253.1/209.2。

1.2.2 對照品溶液的配制 布洛芬對照品溶液的配制：精確稱量消旋布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成含左/右旋布洛芬濃度各500/500 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(消旋布洛芬濃度為1 g·L-1)。隨后用甲醇梯度稀釋成濃度為2/2、5/5、10/10、50/50、200/200、500/500 mg·L-1的左/右旋布洛芬系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃保存，備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精確稱量酮洛芬標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇得酮洛芬濃度為1 g·L-1的儲備液。取適量內(nèi)標(biāo)儲備液，用50%甲醇水稀釋為4 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

質(zhì)控溶液的配制：精確稱量布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成含左/右旋布洛芬濃度各500/500 mg·L-1的質(zhì)控儲備液(消旋布洛芬濃度為1 g·L-1)。隨后用甲醇將質(zhì)控儲備液梯度稀釋成濃度為5/5(LQC)、50/50(MQC)、400/400(HQC)mg·L-1的左/右旋布洛芬QC工作液。

1.2.3 樣品處理方法 于玻璃試管中加入室溫解凍后的血漿樣品200 μL，內(nèi)標(biāo)溶液(4 mg·L-1)50 μL，甲醇20 μL和0.5%磷酸(pH = 1.5)200 μL，用3 mL正己烷(含5%異丙醇)萃取2 min后，4 ℃ 3000 r·min-1離心5 min，取上層有機相1 mL，40 ℃氮氣吹干，殘留物加500 μL復(fù)溶溶液(甲醇 ∶水=80 ∶20，V/V)，渦旋2 min,復(fù)溶后轉(zhuǎn)移于內(nèi)插管中，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)樣6 μL。

1.2.4 給藥設(shè)計 本試驗采用雙周期隨機交叉試驗設(shè)計。兩周期時間間隔為7 d。受試Beagle犬6只，分為A、B兩組，A組2♂1♀，B組2♀1♂。分別按每只0.2 g(1片)右旋布洛芬片和每只0.4 g(2片)消旋布洛芬片給藥。于給藥前、后0.083 3、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、10、12、15、24 h前肢靜脈采血2 mL 左右于真空采血管中，4 000 r·min-1離心5 min，分離出血漿，于-20 ℃保存待測。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析 使用Analyst 1.5.2數(shù)據(jù)處理軟件，對待測物左/右旋布洛芬及內(nèi)標(biāo)酮洛芬進(jìn)行積分，記錄峰面積。以待測物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重為1/X2)進(jìn)行回歸運算，求得的直線回歸方程即為血漿校正曲線。各藥代參數(shù)由WinNonlin 6.3(美國Pharsight公司)計算得出，參數(shù)經(jīng)SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料采用t檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 方法特異性在本研究采用的LC-MS/MS條件下，分別取6個不同來源的犬空白血漿200 μL，除不加待測物及內(nèi)標(biāo)溶液(改加同體積甲醇和50%甲醇水溶液)外，其余按“血漿樣品處理方法”項下操作，進(jìn)行LC-MS/MS分析，獲得空白血漿樣品的色譜圖見Fig 1A；以2.3方式配制的LLOQ樣品進(jìn)行分析的代表性色譜圖見Fig 1B，待測物左旋布洛芬和右旋布洛芬及內(nèi)標(biāo)酮洛芬的色譜保留時間分別為8.67 min、9.64min、8.56 min；犬給藥后血漿樣品的代表性色譜圖見Fig 1C。干擾組分的響應(yīng)低于LLOQ響應(yīng)的1/5及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的1/20，表明犬血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響待測物和內(nèi)標(biāo)的定量分析。

Fig 1 MRM chromatograms for (R-)/(S+) ibuprofen in Beagle plasma

A： a blank plasma sample；B： a blank plasma sample spiked with (R-) ibuprofen(0.2 mg·L-1)，(S+) ibuprofen(0.2 mg·L-1) and IS (4 mg·L-1)；C： a plasma sample after 0.75 h intragastric given 0.4 g ibuprofen enantiomers to Beagle dogs

2.2 左/右旋布洛芬的相互干擾及相互轉(zhuǎn)化

2.2.1 左/右旋布洛芬的相互干擾 配制含低濃度(0.5 mg·L-1)左旋布洛芬和高濃度(40 mg·L-1)右旋布洛芬的血漿樣品以及含高濃度(40 mg·L-1)左旋布洛芬和低濃度(0.5 mg·L-1)右旋布洛芬的血漿樣品，各3只試管。從每只試管中各取200 μL樣品，按“1.2.3”項下處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，所有樣品的RE在96.6%～112%，均在允許范圍(±15%)以內(nèi)，滿足測定的要求，說明同時測定左/右旋布洛芬時，高濃度化合物不會對低濃度化合物產(chǎn)生影響。

2.2.2 左/右旋布洛芬的相互轉(zhuǎn)化 分別配制含有低(0.5 mg·L-1)和高(40 mg·L-1)濃度的消旋布洛芬、左旋布洛芬以及右旋布洛芬的血漿樣品，共6只試管。置37 ℃恒溫水浴，分別于0、1、2 h 3個時間點取樣，按“1.2.3”項下處理，每個濃度進(jìn)行雙樣本分析。結(jié)果顯示，所有2 h的樣品與其相應(yīng)0 h樣品的比值在96.5%～105%之間，說明左/右旋布洛芬的濃度不隨時間發(fā)生改變。此外，在含左旋布洛芬的血漿中測不到右旋布洛芬，含右旋布洛芬的血漿中測不到左旋布洛芬，說明左/右旋布洛芬在血漿中沒有發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。在含消旋布洛芬的血漿中，低濃度和高濃度的左/右旋布洛芬的濃度比，從0～2 h均在99.0%～103%之間，說明左旋布洛芬和右旋布洛芬濃度一致，在不同濃度下不隨時間發(fā)生改變，沒有發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

取左/右旋布洛芬(濃度0.2/0.2 mg·L-1)20 μL加入到200 μL空白血漿中，除不加甲醇外，根據(jù)“1.2.3”項下處理，進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)進(jìn)行3個批次的樣本分析。結(jié)果顯示，該濃度下左/右旋布洛芬的色譜峰信噪比(S/N)均>10，18個樣本的相對誤差(RE)分別為-1.81%和0.139%，批內(nèi)精密度分別為4.19%和3.82%，批間精密度分別為4.82%和1.78%。結(jié)果表明本方法左/右旋布洛芬的定量下限(LLOQ)可以達(dá)到0.2 mg·L-1。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度取“1.2.2”項下配制的高、中、低濃度水平的質(zhì)控樣品20 μL，加入到200 μL空白血漿中，采用“1.2.3”項下的方法進(jìn)行血漿樣品處理，進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄左/右旋布洛芬及內(nèi)標(biāo)MRM檢測的色譜圖峰面積，每個濃度6樣本，連續(xù)進(jìn)行3個批次的樣本分析。應(yīng)用校正曲線計算各QC樣品的測得濃度，考察分析方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見Tab 1。左/右旋布洛芬各濃度水平QC樣品的相對誤差(RE)均介于-2.53%～-0.144%之間，批內(nèi)精密度(RSD)均介于4.22%～6.29%之間，批間精密度(RSD)均介于1.01%～13.1%之間，符合有關(guān)生物樣品分析方法驗證的要求。

Tab 1 Precision and accuracy of (R-)/(S+) ibuprofen analysisin Beagle plasma by LC-MS/MS(n=6)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察樣品A: 取“1.2.2”項下配制的高、中、低濃度水平的質(zhì)控樣品20 μL和50 μL內(nèi)標(biāo)工作液，加入10 mL玻璃試管中，40 ℃下氮氣吹干，加入1.5 mL溶液復(fù)溶后，進(jìn)樣6 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄布洛芬和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積A。樣品B: 向200 μL空白犬血漿中，不加對照品和內(nèi)標(biāo)(以溶劑代替)，按“1.2.3”項下提取后經(jīng)氮氣吹干，用500 μL樣品A復(fù)溶，進(jìn)樣6 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析記錄左/右旋布洛芬和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積B。峰面積比B/A×100%即為左/右旋布洛芬和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，見Tab 2。結(jié)果表明左/右旋布洛芬在3個QC濃度水平上的基質(zhì)效應(yīng)介于97.0%～104%之間，RSD介于1.13%～8.54%之間；內(nèi)標(biāo)酮洛芬的基質(zhì)效應(yīng)為104%，平行測定的RSD為4.27%，基質(zhì)效應(yīng)不會對樣品的分析產(chǎn)生明顯影響。

2.6 提取回收率取“1.2.2”項下配制的高、中、低濃度水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行血漿中左/右旋布洛芬的提取回收率考察，每個濃度6樣本。樣品C：200 μL空白犬血漿加20 μL布洛芬質(zhì)控工作液(0.5/0.5、5/5、40/40 mg·L-1)，按“1.2.3”項下樣品處理方法處理后進(jìn)樣6 μL，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析，記錄布洛芬和內(nèi)標(biāo)酮洛芬的色譜峰面積C。峰面積C/B×100%測得的峰面積比即為左/右旋布洛芬和內(nèi)標(biāo)的提取回收率。結(jié)果見Tab 2, 表明左/右旋布洛芬在3個QC濃度水平上的提取回收率在105%～111%之間，RSD在4.35%～8.53%之間；內(nèi)標(biāo)酮洛芬的提取回收率為82.9%，RSD為7.72%。

Concentration/mg·L-1Matrixeffect/%RSD/%Recovery/%RSD/%(R-)ibuprofen0.597.0±6.576.77111±6.245.625103±4.864.71106±4.604.3540103±1.411.37106±5.425.13(S+)ibuprofen0.599.6±8.508.54108±9.238.535104±5.695.46105±4.144.4140104±1.171.13106±4.934.64Ketoprofen4104±4.424.2782.9±6.407.72

2.7 穩(wěn)定性穩(wěn)定性考察了布洛芬血漿樣品室溫放置4 h、進(jìn)樣器放置24 h、-20 ℃室溫凍融1次、3次循環(huán)、-20 ℃長期凍存穩(wěn)定性。按“1.2.3”項下處理后分析，結(jié)果顯示，血漿樣品中左/右旋布洛芬RE均小于9.5%，表明布洛芬血漿樣品在以上各條件下穩(wěn)定。

2.8 稀釋效應(yīng)制備左/右旋布洛芬濃度為400 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍后進(jìn)行測定，考察稀釋效應(yīng)。結(jié)果顯示，稀釋10倍后測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)所得計算值，與標(biāo)識濃度相比，左旋布洛芬的準(zhǔn)確度(RE)為-2.04%，精密度(RSD)為2.82%；右旋布洛芬的準(zhǔn)確度(RE)為-1.88%，精密度(RSD)為2.64%。表明對血漿樣品進(jìn)行稀釋后分析，經(jīng)校正計算后的結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映超出曲線范圍的藥物濃度。

2.9 Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)[9-10]Beagle犬給予右旋布洛芬片或消旋布洛芬片后，所測得的左/右旋布洛芬的平均血藥濃度-時間曲線見Fig 2。以非房室模型計算所得的各個藥代參數(shù)見Tab 3。動物在給藥后，兩組右旋AUC(0-∞)數(shù)值存在差異(P<0.01)，給予消旋布洛芬之后，其右旋布洛芬的AUC(0-∞)(696.8±235.7) h·mg·L-1，明顯高于單獨給予右旋布洛芬(367.8±62.87) h·mg·L-1；給予消旋體后，其右旋布洛芬的AUC(0-∞)( 696.8±235.7) h·mg·L-1，明顯高于左旋布洛芬的AUC(0-∞)( 181.1±32.13) h·mg·L-1(P<0.01)。給予消旋布洛芬后2 h，左右旋兩對映體濃度之間呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，右旋布洛芬的血藥濃度明顯大于左旋布洛芬；同時兩組右旋數(shù)據(jù)也在給藥后5 h呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，給予消旋體之后，右旋布洛芬血藥濃度明顯大于單獨給予右旋布洛芬。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of (S+) ibuprofenafter an i.g. dose of (S+)ibuprofen (0.2 g)and (S+)ibuprofen,(R-) ibuprofen after an i.g. dose ofibuprofen enantiomers (0.4 g)to Beagle ±s,n=6)

Fig 2 Plasma concentration-time curves of ibuprofen after an i.g. dose of (S+)ibuprofen (0.2 g)and ibuprofen enantiomers (0.4 g)to Beagle dogs (n=6)

3 討論

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014版《藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[10]規(guī)定，本研究建立了同時測定左/右旋布洛芬的定量分析方法。由于對映異構(gòu)體具有幾乎相同的物理性質(zhì)(旋光性除外)和化學(xué)性質(zhì)(在手性環(huán)境中除外)，通常需要特殊的手性技術(shù)對它們進(jìn)行分離和測定。本研究選用手性色譜柱(Lux 5u Cellulose-3)對左/右旋布洛芬實現(xiàn)了色譜分離，分離效果良好。宮愛申等[1]選擇了20°C柱溫測定右旋布洛芬，Cardoso等[11]選擇25℃柱溫對布洛芬對映體進(jìn)行分離，分離效果良好。本研究選擇27°C柱溫并通過優(yōu)化流動相組成和比例，分離效果更好，使兩種待測物之間的分離度達(dá)到了1.69，能滿足色譜分離和定量分析的要求。

由于對應(yīng)異構(gòu)體在體內(nèi)具有不同的藥代動力學(xué)行為，本研究在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)左/右旋布洛芬在犬體內(nèi)的吸收、分布和消除有很大區(qū)別，相同時間點的血藥濃度差異很大?；谝陨?，本研究考察了同時測定左/右旋布洛芬時，兩種化合物的濃度差異是否會對測定造成影響結(jié)果顯示所有樣品均能夠滿足測定的要求，說明同時測定左/右旋布洛芬時，高濃度化合物不會對低濃度化合物產(chǎn)生影響。

根據(jù)文獻(xiàn)報道[3,12-13]，體內(nèi)存在的異構(gòu)化酶可將左旋布洛芬單向轉(zhuǎn)化為右旋布洛芬，而這種轉(zhuǎn)化是否會在血漿中發(fā)生，當(dāng)前的測定方法能否準(zhǔn)確分析血漿中兩個對映異構(gòu)體的濃度，基于以上，本研究考察了左/右旋布洛芬在血漿中的相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示，所有0、1、2 h的樣品相比較，差別不大，說明孵育1 、2 h的血漿樣品，其測得濃度相較0 h沒有下降，左/右旋布洛芬在血漿中的濃度不隨時間發(fā)生改變。單獨含有左旋布洛芬的血漿中始終測不到右旋布洛芬，含有右旋布洛芬的血漿中也測不到左旋布洛芬，說明左/右旋布洛芬在血漿中沒有發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。含低和高濃度消旋布洛芬的血漿里左/右旋布洛芬的濃度比值，從0～2 h均接近于100%，說明左/右旋布洛芬濃度一致，在不同濃度下不隨時間發(fā)生改變，也沒有發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

目前檢測血漿中布洛芬對映體的方法有紫外[14-15]、熒光[16]及質(zhì)譜檢測器[8,11]。采用質(zhì)譜檢測器相對紫外與熒光檢測器，能夠提高檢測的靈敏度和選擇性[11]。本研究建立了同時測定犬血漿中左/右旋布洛芬濃度的LC-MS/MS分析方法，定量范圍均為0.2～50 mg·L-1，方法快速、簡便、靈敏。并按照生物樣品分析的相關(guān)規(guī)范，對該方法的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、線性、準(zhǔn)確度、精密度及穩(wěn)定性等項目進(jìn)行了驗證考察，符合化學(xué)藥物臨床前藥代動力學(xué)研究的技術(shù)要求，可為右旋布洛芬在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)的研究提供依據(jù)。

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Vailidation of a LC-MS/MS method for quantification of ibuprofen enantiomers in Beagle dog plasma

ZHAO Xiu-hong1,2，XIA Yuan-yuan2，HUANG Yu-rong2，ZHANG Ai-jie2，WEI Guang-li2，SI Duan-yun2

(1.GraduateSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China；2.StateKeyLaboratoryofDrugDeliveryTechnologyandPharmacokinetics,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,China)

Aim To develop a simple, rapid and accurate analysis method for determination of chiral ibuprofen in Beagle dog plasma.Method The plasma sample was submitted to liquid-liquid extraction using hexane/isopropanol (95 ∶5,V/V), with ketoprofen as the internal standard (IS). The separation was accomplished in a Lux 5u Cellulose-3 (250 mm·4.6 mm, 5 μm) column, and the mobile phase consisted of methanol and a mixture of 1 mmol·L-1ammonium acetate-methanol-formic acid (90 ∶10 ∶0.2,V/V/V) with the volume ratio of 82 ∶18 at a flow rate of 0.8 mL·min-1. The mass spectrometer consisted of an ESI interface operating at negative ionization mode and the detection was performed using multiple reaction monitoring at the transitions of m/z 205.2/161.2 for ibuprofen and m/z 253.1/209.2 for ketoprofen (IS) . Method validation included the evaluation of the matrix effect, extraction recovery, linearity, lower LOQ, within-run and between-run precision, stability and dilution effect. Results The calibration curve was linear across the concentration range of 0.2～50 mg·L-1for each ibuprofen enantiomer with a lower LOQ of 0.2 mg·L-1. The within-run and between-run precision (RSD%) was in the range 1.01%～13.1% for each ibuprofen. The pharmacokinetic parameters for orally single dose of (S+) and racemic ibuprofen in Beagle dogs were as follows:Cmax,T1/2, AUC(0-t)were (82.98±14.83 ) mg·L-1, ( 3.217±0.7298) h, (362.0±58.67) h·mg·L-1for (S+) ibuprofen and 70.62/74.48 mg·L-1, 1.520/5.432 h ,177.8/649.6 h·mg·L-1for (R-)/(S+) ibuprofen, respectively. Conclusions A simple, rapid, accurate, high sensitivity and repeatability method has been successfully developed, which can analyze the concentrations of (R-)/(S+) ibuprofen in Beagle dog plasma simultaneously. The method could be applied for the investigation of pharmacokinetics of ibuprofen enantiomers in Beagle dogs.

ibuprofen;LC-MS/MS;plasma concertration;Beagle dogs;pharmacokinetics; enantiomers

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.012.html

2014-12-06,

2015-01-04

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目(No 2012ZX09304002)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(No 10SYSYJC28600)

趙秀紅(1989- )，女，碩士生，研究方向：藥代動力學(xué)，Tel：022-84845243，E-mail：zxh1278@163.com; 司端運(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：藥代動力學(xué)， 通訊作者，Tel：022-84845261，E-mail：sidy@tjipr.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.026

A

1001-1978(2015)04-0570-06

R-332；R969.1；R971.1