金文敏，穆殿平

(天津市第一中心醫(yī)院,天津 300192)

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芪參益氣滴丸用于大鼠急性心肌梗死的代謝組學(xué)研究

金文敏，穆殿平*

(天津市第一中心醫(yī)院,天津 300192)

目的：采用UPLC/MS技術(shù)從代謝組學(xué)角度探討芪參益氣滴丸對心肌梗死大鼠的保護作用機制。方法：將60只SD雄性大鼠隨機等分為正常對照組、模型組和給藥組，采用結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型。給藥組灌胃給予芪參益氣滴丸，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水,給藥1周后，腹主動脈取血采用UPLC/MS法分析。結(jié)果：經(jīng)主成分分析及偏最小二乘法分析，模型組與正常對照組明顯分離，而藥物干預(yù)組與模型組分離，并向正常對照組靠近，在代謝組學(xué)的角度證明了芪參益氣滴丸對心肌梗死大鼠的治療作用。實驗共分析鑒別出9個內(nèi)源性生物標記物，分別與磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝通路相關(guān)。 結(jié)論：芪參益氣滴丸可以對心肌梗死大鼠起到很好的保護作用，推測其可能是通過調(diào)節(jié)磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝通路而發(fā)揮作用。

芪參益氣滴丸，心肌梗死，代謝組學(xué)，生物標記物

芪參益氣滴丸由丹參、三七、黃芪和降香4味藥材組成，其中黃芪補中益氣、丹參活血化瘀，共為君藥；三七止血化瘀、活血定痛為臣藥；降香行氣活血為佐使藥，臨床主要用于冠心病、心力衰竭和心絞痛等疾病的治療。現(xiàn)代藥理實驗表明，芪參益氣滴丸能夠改善心肌損傷，心功能減退的各種癥狀，且對心肌梗死二級預(yù)防具有顯著的療效[1]。

代謝組學(xué)運用系統(tǒng)的研究手段，分析生物體受病理生理學(xué)過程或基因變異等干擾刺激后，其體內(nèi)內(nèi)源性代謝物隨時間和各個組織變化的全部代謝變化響應(yīng)[2,3]。

本研究采用代謝組學(xué)的方法，利用超高效液相色譜-四級桿/飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF)對芪參益氣滴丸給藥干預(yù)心肌梗死大鼠的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化進行分析，為心肌梗死的臨床診斷和藥物治療評價提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器 MP-150多導(dǎo)生理記錄儀(BIOPAC systems Inc.，USA)，超高效液相色譜儀串聯(lián)四極桿/飛行時間質(zhì)譜(Waters ACQUITYTM UPLC-Q/TOF Premier)，超純水儀Milli-Q(美國MILLIPORE公司)，Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，MS2型旋渦混勻器(德國IKA集團)。

1.1.2 試藥 乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher)，亮氨酸-腦啡肽醋酸鹽(美國Sigma-Aldrich公司)，水合氯醛(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純)，青霉素鈉注射液(北京悅康凱悅制藥有限公司)，芪參益氣滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，批號141208)。

1.2 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重(230±20) g，由北京維通利華實驗動物中心提供[動物許可證編號：SCXK(京)2012-0004]。

2 方法

2.1 模型的建立 大鼠腹腔注射300 mg/kg水合氯醛麻醉，仰臥位固定，備皮。記錄正常時的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，心電圖無異常者入組實驗。沿左側(cè)第4～5肋骨剪開胸部皮膚，橫行分離肌肉，暴露心臟后輕壓右胸，將心臟擠出胸腔外，使用5-0帶針縫合線，于左前降支起始4 mm處穿線，然后立即將心臟回置胸腔，止血鉗關(guān)閉胸腔。穩(wěn)定10 min后，結(jié)扎動脈，縫合傷口。記錄觀察大鼠心電圖，結(jié)扎后心電圖ST段明顯抬高者造模成功。大鼠術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉預(yù)防感染。

2.2 動物分組、給藥及樣品收集 實驗大鼠分為三組，正常對照組、模型組和給藥組，每組各20只。給藥組灌胃給予芪參益氣滴丸(70 mg/kg)1周，正常對照組及模型組分別灌胃給予等量生理鹽水。大鼠給藥7 d后，將其麻醉，腹主動脈取血于裝有肝素的離心管中，3 000 r/min離心10 min后取上清液存于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品的處理 用移液管取400 μl血漿樣品，加入1 600 μl的50%甲醇，渦旋2 min后在4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min，取上清液1 500 μl減壓濃縮后再加入200 μl 50%甲醇渦旋復(fù)溶，之后在4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min，取上清液直接用于液質(zhì)分析。

2.4 樣品的測定

2.4.1 色譜條件 實驗采用Waters Acquity BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相：乙腈和0.1%甲酸水梯度洗脫，流速為0.4 ml/min，柱溫：35 ℃，進樣5.0 μl，梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動相條件

2.4.2 質(zhì)譜條件 實驗采用電噴霧離子源，正、負兩種模式測定。參數(shù)為：錐孔電壓負模式25 V、正模式30 V；毛細管電壓負模式2.5 kV、正模式3.0 kV；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；脫溶劑氮氣流量600 L/h；錐孔氣流量50 L/h；檢測器電壓1 800 V；采樣頻率0.1 s，間隔0.02 s；質(zhì)量數(shù)檢測范圍100～1 200 Da；內(nèi)參校準液采用亮氨酸-腦啡肽醋酸鹽([M-H]-=553.277 5，[M+H]+=555.293 1)。

2.5 數(shù)據(jù)分析 將所有的液質(zhì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters公司Markerlynx軟件(Waters, MA, USA)進行色譜峰自動識別和峰匹配，采用主成分分析法對正常對照組與模型組以及正常對照組、模型組與給藥組之間的數(shù)據(jù)進行模式識別。初步分析后，再將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Simca-P 軟件 (version 11.5, Demo, Umetrics, Umea, Sweden)進行進一步的偏最小二乘法分析，得到各組間的得分圖和載荷圖。

3 結(jié)果

3.1 心肌梗死生物標記物分析 如圖1所示，為通過UPLC-Q-TOF/MS分析得到的正、負模式下大鼠正常對照組、模型組及給藥組血漿樣本的色譜圖。雖然能部分辨別各組色譜圖的峰數(shù)和峰強度存在差異，但是這種肉眼直接對比得到的信息十分有限。所以，需要對質(zhì)譜圖中所包含的所有離子信息進行信息提取和再處理，以獲取更多的數(shù)據(jù)。通過對正常對照組和模型組實驗數(shù)據(jù)進行PCA及PLS-DA分析，得到了正負模式下的得分圖(見圖2)和載荷圖(見圖3)。

從得分圖中發(fā)現(xiàn)，正常對照組和模型組樣品得到了明顯的分離，說明大鼠心肌梗死造模后血液中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝發(fā)生顯著異常。另外，從圖中還可以看出模型組較正常對照組樣品更加分散，說明模型組個體差異較正常對照組大。

3.2 心肌梗死生物標記物的鑒別 圖3為正常對照組和心梗模型組的PLS-DA載荷圖，從圖3中可分析得到對兩組分類貢獻較大的內(nèi)源性生物標記物。依據(jù)離原點越遠的化合物對于分型的貢獻越大的原則，選取了9個色譜峰為生物標記物。通過將這些生物標記物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫Metabolites Database(http://metlin.scrips.edu)和Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca)進行比對鑒定，共分析出9個生物標記物(見表2)，分別為尿苷-磷酸、油酰甘油磷酯酰膽堿、溶血磷脂膽堿(LPC C20:4)、磷脂酰乙醇胺、羥基二十碳四烯酸、N-甲基花生四烯酰胺、溶血磷脂膽堿(LPC C18:1)、硬脂酰甘油磷脂酰膽堿和溶血磷脂膽堿(LPC C18:0)。其中，有2個標記物在模型組中表現(xiàn)為上調(diào)，7個標記物在模型組中為下調(diào)。由于這些生物標志物是正常對照組與心梗組中有差異的離子，因此很可能反應(yīng)了心肌梗死引起的內(nèi)源性代謝物的變化情況。

A.正模式 B.負模式

A.正模式 B.負模式

A.正模式 B.負模式

表2 潛在生物標志物鑒定結(jié)果

3.3 芪參益氣滴丸對心肌梗死治療作用的代謝組學(xué)分析 實驗以代謝組學(xué)為分析手段，以大鼠血液中的所有小分子代謝產(chǎn)物為分析對象，從整體上考查芪參益氣滴丸對心肌梗死的干預(yù)效果。圖4為正常對照組、模型組和給藥組大鼠血漿的PLS-DA得分圖，分析發(fā)現(xiàn)，在正、負兩個模式下，給藥組大鼠的整體狀態(tài)都開始偏離模型組而靠近正常對照組，說明芪參益氣滴丸給藥后對心肌梗死大鼠起到了很好的治療作用，血漿中的大部分內(nèi)源性小分子化合物同正常組比較沒有明顯差別。另外，通過分析各個生物標記物的峰面積，發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸給藥干預(yù)后能使標記物發(fā)生逆轉(zhuǎn)而趨于正常。由此可見，芪參益氣滴丸可以通過調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠的磷脂代謝、能量代謝和脂肪酸代謝及炎癥反應(yīng)來起到顯著的治療作用。

A.正模式 B：負模式

4 討論

代謝組學(xué)是通過考查生物體系受刺激或擾動前后所有小分子代謝物及其含量的變化，或其動態(tài)變化，來研究生物體系的一門科學(xué)[4,5]。代謝組學(xué)中所研究的代謝物是指生物肌體的代謝中間體和產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸、碳水化合物、色素、芳香酸、甾醇等初級和次生代謝產(chǎn)物。其研究對象包括整個生物體、尿液、血液、組織、組織提取物和細胞等[6]。代謝組學(xué)在疾病診斷和預(yù)后監(jiān)測、藥物藥效安全性評價、病理學(xué)研究及營養(yǎng)代謝研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。由于代謝組學(xué)強調(diào)研究的整體性，對生物體的整體擾動進行研究和探討，因此其理論核心和中醫(yī)中藥的整體協(xié)同作用的基礎(chǔ)一致。由于近幾年分析技術(shù)的發(fā)展和數(shù)據(jù)處理方法的更新，使得代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)中藥研究領(lǐng)域得以廣泛的應(yīng)用，進而使中醫(yī)藥這種復(fù)雜體系對生命體復(fù)雜體系干擾的作用途徑得以較清楚的揭示。目前，已有多個療效顯著的中藥復(fù)方進行了代謝組學(xué)研究，并取得了較好效果[7]。

本研究采用大鼠心臟冠脈左前降支結(jié)扎造心肌缺血模型，芪參益氣滴丸給藥干預(yù)后，以代謝組學(xué)為分析手段，通過對大鼠血液的聚類分析發(fā)現(xiàn)模型組的硬脂酰甘油磷脂酰膽堿、溶血磷脂膽堿、磷脂酰乙醇胺等代謝水平下調(diào)，涉及能量代謝、磷脂代謝及脂肪酸代謝、炎癥變化等相關(guān)代謝通路，說明心肌梗死與這些通路的變化密切相關(guān)。

能量代謝障礙是心臟病重要的病理生理環(huán)節(jié)，心肌的能量來源于血液中游離脂肪酸和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)。冠脈結(jié)扎后，大鼠缺血心肌內(nèi)的ATP會明顯減低，此時心肌內(nèi)?；o酶A合成酶(CoAS)的活性顯著降低，會導(dǎo)致游離脂肪酸和磷脂代謝的紊亂[8]。本實驗鑒定出的心肌梗死潛在生物標志物中，有眾多磷脂類的物質(zhì)，如溶血磷脂膽堿(LPC C20:4)、溶血磷脂膽堿(LPC C18:1)和溶血磷脂膽堿(LPC C18:0)，這說明磷脂代謝紊亂很可能是造成缺血損傷后心肌梗死代謝異常的主要原因。

在心肌梗死發(fā)生后，磷脂酶活化，促使花生四烯酸在缺血心肌的聚集，導(dǎo)致花生四烯酸代謝產(chǎn)物相應(yīng)增加[9]?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)加氧酶前列腺素G2(PGG2)、前列腺素H2(PGH2)、前列腺素E2(PGE2)進一步轉(zhuǎn)化為血栓烷A2(TXA2)、血栓烷B2(TXB2)，PGE2等能夠誘發(fā)炎癥、促進局部血管擴張，TXA2及PGE2能促進血小板凝集、血管收縮，促進凝血和血栓的形成，造成一系列嚴重的心血管疾病?；ㄉ南┧岬拇x異常對心臟的正常功能有著極大的影響，可導(dǎo)致心臟的收縮力下降，心輸出量減少，甚至可誘發(fā)或加重心肌梗死和心絞痛[10]，很有可能是缺血損傷后心肌梗死發(fā)生的重要機制之一。

1 商洪才. 芪參益氣滴丸對心肌梗塞二級預(yù)防的臨床試驗研究通過專家組驗收[J].天津中醫(yī)藥, 2010, 27(4): 266

2 Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. “Metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181-1189

3 Nicholson J K, Connelly J, Lindon J C,etal. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(2): 153-161

4 German J B, Roberts M A, Fay L,etal. Metabolomics and individual metabolic assessment: the next great challenge for nutrition[J]. J Nutr, 2002, 132(9):2486-2487

5 Li H, Jiang Y, He F C. Recent development of metabonomics and its applications in clinical research[J]. Yi chuan, 2008, 30(4):389-399

6 Fiehn O. Metabolic networks of Cucurbita maxima phloem [J]. Phytochemistry, 2003, 62(6):875-886

7 王廣基, 郝海平, 阿基業(yè),等. 代謝組學(xué)在中藥方劑整體藥效作用及機制研究中的應(yīng)用與展望[J].中國天然藥物, 2009,7(2):82-89

8 Lopaschuk G D, Belke D D, Gamble J,etal. Regulation of fatty acid oxidation in the mammalian heart in health and disease[J]. Biochim Biophys Acta, 1994, 1212(3): 263-276

9 袁成凌，姚建銘，余增亮.花生四烯酸及其代謝物的生物學(xué)作用 [J].中國藥物化學(xué)雜志，2000,10(1):75-78

10 Wang Y, Li C, Liu Z,etal. DanQi Pill protects against heart failure through the arachidonic acid metabolism pathway by attenuating different cyclooxygenases and leukotrienes B4 [J]. BMC Complement Altern Med,2014,14:67

2015-09-18

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1006-5687(2015)06-0009-04

*通訊作者：穆殿平，E-mail：ping_md0208@163.com。