李士偉，關(guān) 鋒，李 想

（1.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122 3.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122）

鐵過載引發(fā)人肝細(xì)胞HH4 N-糖鏈表達(dá)差異研究

李士偉1,2，關(guān) 鋒1,2，李 想3

（1.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122 3.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122）

肝臟鐵過載是血液系統(tǒng)疾病患者進(jìn)行骨髓移植后的典型并發(fā)癥之一，長(zhǎng)期鐵過載可引發(fā)肝臟細(xì)胞凋亡和器官損壞，然而鐵過載的分子調(diào)控機(jī)理迄今仍不清楚。以培養(yǎng)的枸櫞酸鐵銨過載人肝細(xì)胞HH4和正常人肝細(xì)胞HH4為研究對(duì)象，細(xì)胞裂解提取總蛋白，分子篩超濾管分離獲得總糖肽，PNGase F酶解釋放出N-糖鏈，Sepharose 4B除鹽純化N-糖鏈，再利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術(shù)比較N-糖鏈變化情況。同時(shí)，采用熒光細(xì)胞凝集素免疫組化方法驗(yàn)證糖鏈分析結(jié)果。結(jié)果在鐵過載人肝細(xì)胞和正常細(xì)胞中均檢測(cè)到16種N-糖鏈，但糖鏈豐度存在明顯差異。與正常人肝細(xì)胞相比，鐵過載人肝細(xì)胞中高甘露糖型糖鏈的含量降低，而雜合型、復(fù)雜型、平分型、巖藻糖化和唾液酸化糖鏈的含量明顯升高。凝集素免疫組化結(jié)果顯示鐵過載后細(xì)胞對(duì)凝集素ConA的親和作用減弱，而對(duì)PHA-E、AAL、LCA和MAL-II的親和作用增強(qiáng)，與糖鏈質(zhì)譜分析結(jié)果相一致。研究為進(jìn)一步探索人肝細(xì)胞鐵過載模式下N-糖鏈表達(dá)差異的分子機(jī)理提供了技術(shù)支持。

鐵過載；人肝細(xì)胞HH4；MALDI-TOF/TOF-MS；N-糖鏈；凝集素免疫組化

骨髓移植是當(dāng)前臨床根治急慢性白血病、嚴(yán)重型再生不良性貧血、地中海性貧血、淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等惡性疾患的主要手段［1］，然而越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)骨髓移植后，病人的肝臟出現(xiàn)典型的鐵過載癥狀進(jìn)而引發(fā)肝損傷［2-3］。早在2000年，國(guó)際上已經(jīng)開始關(guān)注和研究作為骨髓移植并發(fā)癥存在的肝臟鐵過載現(xiàn)象，但是迄今肝臟鐵過載的具體分子調(diào)控機(jī)理仍不清楚。

鑒于先前肝臟鐵過載研究大多集中于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面，本實(shí)驗(yàn)擬利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)從糖組學(xué)角度觀察鐵過載中糖鏈表達(dá)的狀態(tài)。糖組學(xué)的主要研究對(duì)象為糖鏈，通常生物體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將糖鏈附加到蛋白質(zhì)或脂質(zhì)上以形成功能性糖綴合物，這個(gè)過程稱之為糖基化。其中，蛋白質(zhì)的糖基化作用是最普遍和最主要的蛋白質(zhì)翻譯后加工方式之一，蛋白質(zhì)的糖基化有助于肽鏈的正確折疊，保護(hù)蛋白質(zhì)免受水解以及影響蛋白質(zhì)的正確投送和定位［4-5］。研究表明真核生物中約50%以上的蛋白質(zhì)是被糖基化的，而在人類蛋白質(zhì)中更高達(dá)70%［6］。生物體內(nèi)糖基化修飾根據(jù)寡糖鏈與蛋白質(zhì)連接方式的不同主要分為4種：N-連接糖鏈，O-連接糖鏈，糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨和糖胺聚糖［7］。哺乳動(dòng)物中的糖鏈主要存在于多種膜蛋白、酶、激素、生長(zhǎng)因子、抗體和免疫球蛋白中，因此糖鏈可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多重要功能，如分子及細(xì)胞間的相互識(shí)別，胞內(nèi)或胞外信號(hào)傳導(dǎo)，免疫應(yīng)答以及炎癥發(fā)生等［8］。

當(dāng)前糖組學(xué)研究主要利用高相液相色譜（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、核磁共振（NMR）以及生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)糖鏈進(jìn)行定性定量分析和結(jié)果解析。而生物質(zhì)譜中的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)更是因其具有靈敏快捷、圖譜解析簡(jiǎn)單、質(zhì)量檢測(cè)上限高、對(duì)雜質(zhì)的包容性強(qiáng)、無需預(yù)分離混合物和可分析fmol至pmol范圍內(nèi)的糖鏈結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中。此外，凝集素作為一類源于各種植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物的糖結(jié)合蛋白具有能特異性識(shí)別特定糖鏈結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，而以熒光標(biāo)記凝集素作為探針分子的凝集素組織化學(xué)技術(shù)能夠直觀顯示細(xì)胞中糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的差異變化，已被廣泛應(yīng)用于不同組織或細(xì)胞糖綴合物研究。

本研究以枸櫞酸鐵銨（FAC）過載前后的人肝細(xì)胞HH4為研究對(duì)象，利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)和凝集素組織化學(xué)技術(shù)比較分析N-糖鏈譜的變化差異，擬為糖組學(xué)水平以及糖蛋白質(zhì)組學(xué)水平上深入研究肝細(xì)胞鐵過載的分子機(jī)制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

非轉(zhuǎn)化人肝細(xì)胞株HH4獲贈(zèng)于美國(guó)西雅圖Fred-Hutchinson Cancer Research Center(FHCRC)Joachim Deeg教授實(shí)驗(yàn)室。Williams'medium E培養(yǎng)基、HEPES(20mmol/L)和丙酮酸鈉(1mmol/L)購于Gibco公司；胎牛血清和青霉素溶液購于Life Technologies公司；地塞米松(0.04μg/m L)和慶大霉素(50μg/m L)購于美國(guó) Sigma-Aldrich公司；ITS（Insulin-transferrinselenium）購于美國(guó)BD公司；

苯甲基磺酰氟（PMSF）和抑肽酶購自Thermo Scientific公司；T-PER組織總蛋白抽提試劑購于美國(guó)Thermo公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；離心超濾管Am icon Ultra-0.5 10 kD購于美國(guó)M illipore公司；檸檬酸鐵銨（FAC）、瓊脂糖凝膠Sepharose 4B、尿素（UREA）、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）、正丁醇、乙醇和2,5-二羥基苯酸乙酯(DHB)購于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；PNGase F酶購自美國(guó)New England Biolabs公司；Sephadax G-25（葡聚糖凝膠柱）購自Amersham Pharmacia Biotech公司；氨基反應(yīng)性Cyanine3 NHS ester(花青素3-N-羥基琥珀酰亞胺酯)購于Lumiprobe公司；凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II購自Vector公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HH4細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）、0.1%ITS、0.04μg/m L地塞米松、50μg/m L慶大霉素、20mmol/L的HEPES和1mmol/L的丙酮酸鈉的Williams培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2.2細(xì)胞總蛋白的提取

0、5和10mmol/L枸櫞酸鐵銨分別處理HH4細(xì)胞24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。冷1×PBS洗細(xì)胞3次，加入適量T-PER組織蛋白裂解液、PMSF（工作濃度1%）和抑肽酶（工作濃度1‰）冰浴30min，12000 r/min離心15min，取上清利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 N-糖鏈的釋放

取2mg細(xì)胞總蛋白加入到10 kD離心超濾管中13800 r/min離心5m in濃縮。加入8M尿素（8M高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性溶解）、10mM的DTT溶液和20 mM的IAM溶液使蛋白質(zhì)變性溶解。棄流出液。加入PNGaseF酶解緩沖液，37℃酶解反應(yīng)12 h。收集樣品冷凍干燥，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 N-糖鏈的除鹽純化

取適量Sephrose4B至微量離心管中，向離心管中加入1∶1的甲醇∶水溶液和5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液（體積分?jǐn)?shù)）離心清洗Sephrose 4B。加入500μL的5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液溶解凍干的糖鏈樣品，上樣至Sephrose 4B中，25℃振蕩反應(yīng)45m in。5∶1∶1的正丁醇∶甲醇∶水溶液清洗3次后，采用1∶1的甲醇∶水溶液洗脫糖鏈，收集洗脫液冷凍干燥。

1.2.5糖鏈的質(zhì)譜分析

應(yīng)用 Bruker Daltonics公司的 UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF-MS解析糖蛋白的N-連接糖鏈。加入5μL的1:1的甲醇：水溶液溶解凍干糖鏈樣品，取2μL糖鏈溶液點(diǎn)樣于MTPAnchorchip 384點(diǎn)的靶板上。晾干后，再加1μL的20mg/m L的基質(zhì)DHB至樣品板上。以反射陽性離子模式鑒定多糖。一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如下:離子源1，7.50 kV；離子源2，6.75 kV；反射電壓1，29.5 kV；反射電壓2，13.95 kV；LIFT 1，19 kV；LIFT 2，3.7 kV。激發(fā)光源為N2激光（337 nm），分子量檢測(cè)范圍為700～4000。用多肽校正混合物作為外標(biāo)校正質(zhì)譜儀。檢測(cè)時(shí)每個(gè)樣品在多點(diǎn)采集圖譜，每個(gè)圖譜掃描1500次，最后將所有譜圖疊加得到最后的多糖一級(jí)圖譜。從一級(jí)圖譜中選擇信噪比大于6的質(zhì)譜峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。

通過軟件FlexAnalysis v3獲得糖鏈質(zhì)譜圖和原始數(shù)據(jù)。利用軟件Glycoworkbench 2分析并獲得可能性最高的糖鏈結(jié)構(gòu)。

1.2.6熒光細(xì)胞凝集素免疫組化

用1μL Cy3（10μg/μL）對(duì)應(yīng)200μg凝集素，在Na2CO3溶液中反應(yīng)3 h，用Sephadax G-25分離收集標(biāo)記后的凝集素。將HH4細(xì)胞接種于裝有滅菌蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合約70%時(shí)，用0、5和10 mmol/L枸櫞酸鐵銨分別處理HH4細(xì)胞24 h。PBS漂洗后，2%多聚甲醛固定15min。再用PBS振蕩漂洗3次。0.2%Triton X-100溶液通透細(xì)胞10m in，PBS漂洗3次，5%BSA溶液4℃封閉過夜。每孔分別加入Cy3標(biāo)記凝集素室溫避光振蕩孵育3 h，PBS振蕩清洗3次。0.5μg/m LDAPI室溫下避光染色15m in，PBS振蕩清洗3次。將蓋玻片倒扣在滴有Glycergel固定劑的載玻片上，利用激光共聚焦顯微鏡（Nikon Eclipse E600）對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行掃描和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HH4細(xì)胞鐵過載前后N-糖鏈的質(zhì)譜分析

本研究借助Am icon Ultra-0.5 10 kD濾膜的分子篩效應(yīng)對(duì)HH4胞內(nèi)糖鏈進(jìn)行釋放和分離，使用親水樹脂Sepharose 4B對(duì)分離的糖鏈除鹽純化，通過UltrafleXtremeMALDI-TOF/TOF-MS獲得HH4細(xì)胞鐵過載前后N-糖鏈的指紋圖譜，最后利用軟件GlycoWorkbench對(duì)信噪比高于6的糖鏈質(zhì)譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息注釋（圖1）。在此之上，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)各分子量的糖鏈進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜解析，圖2所示為2個(gè)隨機(jī)挑選的N-糖鏈二級(jí)質(zhì)譜峰圖，分別為m/z 1743.695的高甘露糖型N-糖鏈和m/z 2174.901的巖藻糖化修飾的N-糖鏈。從正常肝細(xì)胞HH4和鐵過載肝細(xì)胞HH4 N-糖鏈一級(jí)質(zhì)譜圖中可以看出N-連接糖鏈結(jié)構(gòu)主要分布在1200～2600之間，且各實(shí)驗(yàn)組糖鏈指紋圖譜非常相似。結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果，確定正常肝細(xì)胞HH4和鐵過載肝細(xì)胞HH4含有16個(gè)相對(duì)不同強(qiáng)度的糖鏈結(jié)構(gòu)，各N-糖鏈質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及結(jié)構(gòu)信息如表1所示。為分析正常肝細(xì)胞HH4和鐵過載肝細(xì)胞HH4N-糖鏈的表達(dá)，根據(jù)糖鏈分子量大小、天線的數(shù)目和糖殘基的豐度對(duì)N-糖鏈進(jìn)行了分類比較。如表2所示，本實(shí)驗(yàn)將表1中HH4細(xì)胞N-糖鏈分類成高甘露糖型、雜合型、復(fù)雜型（包括二天線型、三天線型和四天線型）、平分型、巖藻糖化和唾液酸化，然后分別累加每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各類型糖鏈的相對(duì)強(qiáng)度值并計(jì)算各類型糖鏈在對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組中所占比重。結(jié)果表明，與正常人肝細(xì)胞相比，5mM枸櫞酸鐵銨處理肝細(xì)胞和10mM枸櫞酸鐵銨處理肝細(xì)胞高甘露糖型糖鏈的含量呈枸櫞酸鐵銨濃度依賴性降低，而雜合型、復(fù)雜型（包括二天線型、三天線型和四天線型）、平分型、巖藻糖化和唾液酸化糖鏈的含量呈明顯枸櫞酸鐵銨濃度依賴性升高。

2.2 HH4細(xì)胞鐵過載前后凝集素免疫組化分析結(jié)果

圖1 正常肝細(xì)胞HH4和鐵過載肝細(xì)胞HH4 N-糖鏈一級(jí)質(zhì)譜圖Fig 1 MALDI-TOF-MSspectra of N-glycans from HH4 cellsand iron overloaded HH4 cells

為了進(jìn)一步驗(yàn)證N-糖鏈質(zhì)譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)針對(duì)性的選取了凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II進(jìn)行凝集素組織化學(xué)分析。吲哚菁熒光染料Cy3摩爾吸光系數(shù)高且性能優(yōu)良已作為生物熒光探針分子廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用Cy3對(duì)5種凝集素進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后分別與鐵過載前后HH4細(xì)胞孵育，最后通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描分析。熒光掃描結(jié)果如圖3所示，與正常人肝細(xì)胞相比，凝集素ConA耦合后的鐵過載肝細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低，表明鐵處理后胞內(nèi)高甘露糖型糖鏈結(jié)構(gòu)的表達(dá)下降；凝集素PHA-E耦合后的鐵過載肝細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明鐵處理后胞內(nèi)平分型N-乙酰葡萄糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)(bisecting GlcNAc)的表達(dá)上升；凝集素AAL和LCA耦合后的鐵過載肝細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明鐵處理后胞內(nèi)末端巖藻糖化(TerminalαFuc)和α1-6核心巖藻糖(Fucose α1-6GlcNAc)化的糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)上升；凝集素MAL-II耦合后的鐵過載肝細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明鐵處理后胞內(nèi)α2-3唾液酸(Sia2-3Galβ1-4GlcNAc)化的糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)上升。以上5種凝集素的鐵過載前后化學(xué)分析結(jié)果均與糖鏈質(zhì)譜分析結(jié)果相一致。

圖2 m/z 1743.613和2174.901的糖鏈二級(jí)圖Fig 2 MALDI-TOF/TOF-MS/MSanalysisof glycansw ith m/z 1743.695 and 2174.901

3 討論

鐵元素是人體內(nèi)必需的微量元素，為幾乎所有的生命體所必需，在DNA合成、電子傳遞、氧氣運(yùn)輸?shù)壬锎x過程中發(fā)揮了重要的作用［9-10］。當(dāng)機(jī)體內(nèi)鐵過多時(shí)則被稱為“鐵負(fù)荷過載”,主要體現(xiàn)在血清游離鐵和結(jié)合鐵的濃度增高。一般認(rèn)為男性血清鐵蛋白質(zhì)量濃度＞300 ng/m L，女性血清鐵蛋白＞200 ng/m L，或轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度＞45%即可以診斷為鐵過載［11］。近年來陸續(xù)有研究證實(shí)血液系統(tǒng)疾病患者骨髓移植后鐵代謝存在明顯紊亂，表現(xiàn)為不同程度的鐵負(fù)荷過高，而長(zhǎng)期鐵過載可引發(fā)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷乃至肝臟器官纖維化、肝硬化和肝癌等嚴(yán)重的病理改變［12］。目前臨床上利用地拉羅司(Deferasirox,DFX或ICL670)等祛鐵藥物降低實(shí)質(zhì)細(xì)胞鐵水平并改善MDS患者預(yù)后，但祛鐵藥物治療是一個(gè)漫長(zhǎng)且昂貴的過程［13］。基于此，近年來國(guó)際上關(guān)于鐵過載的研究越來越受到關(guān)注，但是其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制仍不清晰。當(dāng)前很多的研究多從基因水平和蛋白質(zhì)水平解析鐵過載導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷機(jī)制［14-17］，而鐵過載引發(fā)的肝細(xì)胞糖譜變化迄今尚未見報(bào)道，因此本文擬從糖組學(xué)角度闡述肝細(xì)胞鐵過載前后全糖鏈變化，為肝細(xì)胞鐵過載研究提供新的思路。

表1 正常肝細(xì)胞HH4和鐵過載肝細(xì)胞HH4各N-糖鏈質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及結(jié)構(gòu)信息Table 1 Proposed structuresand theirmolecular ions in MALDI spectraof N-Glycans from control,5mM FAC-treated and 10mM FAC-treated groups

表2 不同類型N-糖鏈的相對(duì)變化Table2 Relative variation of different typesof N-Glycans

圖3 鐵過載前后HH4細(xì)胞與凝集素相結(jié)合的熒光細(xì)胞凝集素免疫組化圖（60×）Fig 3 Theaffinity of different lectins to HH4 cellsbeforeand after FAC treatmentanalyzed by fluorescence cell lectin-immunochem istry(60×)

實(shí)驗(yàn)利用布魯克公司新型1 kHz高通量質(zhì)譜儀UltrafleXtremeMALDI-TOF/TOF-MS對(duì)枸櫞酸鐵銨過載人肝細(xì)胞HH4前后N-糖鏈的指紋圖譜進(jìn)行鑒定，然后篩選信噪比高于6的糖鏈質(zhì)譜峰依托Glycoworkbench軟件進(jìn)行注釋。結(jié)果表明枸櫞酸鐵銨過載人肝細(xì)胞HH4后N-糖鏈發(fā)生明顯的差異變化，細(xì)胞高甘露糖型表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性降低，而雜合型、復(fù)雜型、平分型、巖藻糖修飾以及唾液酸修飾則表現(xiàn)為濃度依賴性升高（圖1和表1）。其中，m/z為1793.760、1955.826和2101.891巖藻糖化和唾液酸化的N-糖鏈含量增加最為明顯。本文接著利用熒光Cy3標(biāo)記的凝集素ConA、PHA-E、AAL、LCA和MAL-II對(duì)鐵處理前后的肝細(xì)胞進(jìn)行免疫親和反應(yīng)，激光共聚焦掃描結(jié)果顯示鐵處理導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)凝集素ConA親和降低，而對(duì)凝集素PHA-E、AAL、LCA和MAL-II親和增強(qiáng)，驗(yàn)證了質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果（圖3）。

另據(jù)報(bào)道，胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白具有較普遍的糖基化修飾現(xiàn)象，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2（TfR2）的胞外域上攜有的4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)能促進(jìn)TfR2亞基間二硫鍵高效形成以及維持TfR2蛋白穩(wěn)定［21］。此外，近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)N-糖鏈巖藻糖化和唾液酸化水平變化與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。例如，α-1,6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fut8）能夠催化巖藻糖分子轉(zhuǎn)移到N-糖鏈核心五糖最內(nèi)側(cè)的與Asn相連的β-N-乙酰葡糖胺基上添加巖藻糖，而Goupille等報(bào)道在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶能夠抑制凋亡［18］，同時(shí)楊雪松等也證實(shí)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV過表達(dá)能夠抑制A43l細(xì)胞凋亡［19］。溶酶體唾液酸酶(Neu1)能夠水解運(yùn)輸至溶酶體的糖蛋白酮糖苷鍵而釋放出非還原末端的唾液酸，而趙豫剛等人的研究則表明大鼠睪丸上皮細(xì)胞唾液酸含量與凋亡呈明顯負(fù)相關(guān)［20］。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究證實(shí)肝細(xì)胞鐵過載能夠激活胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡，基于此實(shí)驗(yàn)下一步計(jì)劃利用凝集素親和CLINPROT技術(shù)(液體蛋白芯片指紋圖譜解決方案)篩選觀察肝細(xì)胞鐵過載模式下鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況并明確糖鏈修飾變化對(duì)其蛋白功能發(fā)揮的影響，以及分析鐵過載前后多種糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)糖苷酶的表達(dá)差異。

總之，本實(shí)驗(yàn)利用MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)和凝集素免疫組化方法首次證實(shí)枸櫞酸鐵銨過載能夠誘導(dǎo)HH4細(xì)胞雜合型、復(fù)雜型、平分型、巖藻糖修飾以及唾液酸修飾N-糖鏈的表達(dá)，同時(shí)抑制高甘露糖型N-糖鏈的表達(dá)，研究將有助于闡明鐵過載引發(fā)的肝細(xì)胞糖譜變化，為骨髓移植引發(fā)肝細(xì)胞鐵過載的具體分子機(jī)理提供重要的理論參考。

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Study on differentialexpression of N-linked glycans in iron overload-induced human hepatocytesHH 4

LIShi-wei1,2,GUAN Feng1,2,LIXiang3
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry&Biotechnology M inistry of Education;
2.Schoolof Biotechnology; 3.WuxiMedical School,Jiangnan University,Wuxi214122,China）

Hepatic iron overload is common in patients undergoing hematopoietic cell transplantation and may be associated w ith hepatic injury.Here iron overloadmodel of HH4 cells induced by FAC(ferric ammonium citrate)was established.The total proteins of HH4 cells treated w ith or w ithout FAC were extracted,and total glycopeptides were isolated by an ultrafiltration unit.The glycopeptides were enzymatically hydrolyzed by Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)and the released N-linked glycans were desalinated using Sepharose 4B.The structures of the purified N-glycans were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS).Furthermore,the comparative expression of N-glycans was analyzed by lectin immunohistochem istry.The result indicated that 16 N-glycanswere differentially expressed in HH4 cells treated w ith orw ithout FAC.The levels of high-mannose-type N-glycanswere decreased significantly,while the expression of hybrid type, complex type,bisecting type,fucosylation and sialylation of glycanswere enhancedmarkedly in FAC-treated HH4 cells.Consistentw ith MS analysis,lectin immunohistochem istry study showed that the binding affinity to lectin ConA was reduced in FAC-treated HH4 cells,but the binding affinities to 4 lectins PHA-E,AAL,LCA and MAL-IIwere significantly increased.The present research provides the fundamentalobservations for furtherunderstanding functional rolesof differentialexpression of N-linked glycans in ironoverload HH4 cells.

iron overload;human hepatocytes HH4;MALDI-TOF/TOF-MS;N-linked glycans;lectin immunohistochem istry

R735.7

A

2095－1736（2015）03－0009－06

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.009

2014-10-24；

2014-12-15

國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31400691）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20140169）

關(guān)鋒，教授，主要從事糖生物學(xué)方面研究，E-mail:fengguan@jiangnan.edu.cn；李想，副教授，研究方向?yàn)楣撬栉h(huán)境對(duì)造血干細(xì)胞的發(fā)育以及分化的影響，E-mail:xiangli@jiangnan.edu.cn。