閆姍姍，周 艷，李 溪，張 磊，孫茂盛，解裕萍，李鴻鈞

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，昆明650032）

下調(diào)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞Mbd3基因shRNA慢病毒的構(gòu)建及鑒定

閆姍姍1，周 艷1，李 溪2，張 磊1，孫茂盛1，解裕萍1，李鴻鈞1

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，昆明650032）

研究構(gòu)建靶向抑制人Mbd3表達(dá)的shRNA慢病毒顆粒，感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并用嘌呤霉素篩選獲得Mbd3穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討Mbd3在誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞形成中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究根據(jù)Gene Bank中公布的Mbd3基因序列設(shè)計(jì)特異性siRNA干擾序列并合成可產(chǎn)生shRNA的雙鏈DNA，經(jīng)雙酶切后克隆至pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體上構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌PCR檢測篩選陽性質(zhì)粒，利用HEK293Ta包裝產(chǎn)生含有Mbd3shRNA的慢病毒顆粒。通過RT-PCR和Western blot檢測慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSC）后Mbd3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步檢測重組慢病毒對Mbd3的沉默效果并篩選出最佳抑制效果的shRNA慢病毒載體。結(jié)果顯示成功構(gòu)建并篩選出下調(diào)Mbd3的最佳慢病毒干擾載體，慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞48h后于熒光顯微鏡下可見綠色熒光，經(jīng)嘌呤霉素篩選9 d后，RT-PCR檢測Mbd3表達(dá)顯著降低，Western blot檢測Mbd3蛋白表達(dá)明顯減少。說明構(gòu)建的shRNA重組慢病毒包裝成功，具有較高的感染活性，可有效抑制人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞Mbd3的表達(dá)，為后續(xù)研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞跨胚層分化打下前期研究基礎(chǔ)。

Mbd3基因；基因沉默；慢病毒載體；RNA干擾

Mbd3是甲基化CpG結(jié)合蛋白家族中的主要成員，能與甲基化CpG二核苷酸特異性結(jié)合并相互作用，也是核小體去乙酰化復(fù)合體（NuRD）的核心組成部分，通過DNA甲基化和組蛋白去乙?；M(jìn)行表觀遺傳修飾［1-3］。但Mbd3并不像其他MBD蛋白一樣，不與甲基化的CpG結(jié)合，而是直接與NuRD的亞單位Chd4結(jié)合［4］。Mbd3廣泛存在于哺乳動物、昆蟲、線蟲、植物的幾乎所有細(xì)胞中,這種現(xiàn)象十分罕見，也因此引起了研究工作者對Mbd3的關(guān)注。Mbd3對早期的細(xì)胞發(fā)育，維持胚胎干細(xì)胞的多能性和多能細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用［5-6］。研究表明，Mbd3可以通過抑制Cdx2的表達(dá)從而抑制鼠胚胎干細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層分化，對維持鼠胚胎干細(xì)胞的全能性起到重要的表觀調(diào)控作用［7-8］。Keisuke等［1］發(fā)現(xiàn)抑制Mbd3的表達(dá)能夠阻止內(nèi)細(xì)胞團(tuán)向外胚層的分化并進(jìn)一步推測Mbd3/NuRD對多能細(xì)胞的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。2013年Rais等［9］人發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Oct4,Sox2,Klf4和Myc的同時(shí)抑制Mbd3的表達(dá)可快速高效地將體細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSC，有力的證明了Kaji等的推測［1］。在前期研究中，我們能夠?qū)㈤g充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，但分化效率不高。因此，我們提出假設(shè)，直接下調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞Mbd3的表達(dá)是否同樣可提高間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力，提高細(xì)胞的跨胚層分化潛能，為進(jìn)一步研究iPSC的形成奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過構(gòu)建Mbd3 shRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，篩選穩(wěn)定下調(diào)Mbd3表達(dá)的細(xì)胞株，為將來研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞跨胚層分化及誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞的優(yōu)化條件打下前期研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSC）從新生兒臍帶組織中分離得到，HEK293Ta細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基（CORNING），MEM-α培養(yǎng)基（Hy-Clone），Opti-MEM（Gibco），胎牛血清（Biological Industries），EndoFectin-Lenti轉(zhuǎn)染試劑購自廣州復(fù)能基因有限公司，pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體購自北京英茂盛業(yè)生物技術(shù)有限公司，Eco RI和Bam HI限制性內(nèi)切酶（TaKaRa），T4 DNA連接酶（TaKaRa），質(zhì)粒小提試劑盒（Omega），DH5α大腸桿菌本實(shí)驗(yàn)室保存。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），PVDF膜（M illipore），兔抗人Mbd3一抗（Cell Singnaling)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（KLP）。高純總RNA提取試劑盒（百泰克），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），Real-time PCR試劑（BIO-RAD）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)

取健康新生兒臍帶剪成2～3 cm，用含1%雙抗的PBS溶液充分洗滌殘留在臍帶表面的血漬，剔除臍帶中的臍靜脈、臍動脈、華爾通氏膠（Wharton’s Jelly，WJ），將臍帶最外側(cè)的組織剪碎至1mm×1mm×1 mm大小，接種于T-25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，倒置放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，待組織塊貼壁牢固后加入含有15%胎牛血清，1%雙抗，1%谷氨酰胺的α-MEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%時(shí)，即可去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%左右，用0.125%胰酶消化，1∶2傳代培養(yǎng)。293Ta細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)用0.25%胰酶消化，1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Mbd3特異性靶序列的設(shè)計(jì)及慢病毒載體的構(gòu)建

Mbd3的特異性靶序列由北京英茂盛業(yè)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo 4條。其特異性靶序列分別為：Mbd3 shRNA1-CGGTG ACCAAGATTACCAA，Mbd3 shRNA2-CATTGACCT TAGGCCCATA，Mbd3 shRNA3-CTGTCAGAGTCAA AGCACA，Mbd3 shRNA control-ATCGACTAGCCACT TAGAC。Eco RI和Bam HI對雙鏈DNA oligo和載體進(jìn)行雙酶切后用T4 DNA連接酶16℃鏈接過夜構(gòu)建pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A環(huán)狀質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃,240 r/m in培養(yǎng)過夜，以提取慢病毒重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，篩選陽性克隆，PCR引物為：U6F-GACTATCATATGCTTACCGTAAVT和 U6RGGTGGATGTGGAATGTGTG，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2m in;95℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃10m in。并將篩選到的陽性質(zhì)粒送去大連寶生物公司測序。

1.2.3慢病毒的包裝

制備慢病毒穿梭質(zhì)粒pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A及其慢病毒包裝輔助質(zhì)粒PH1和PH2，3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞后，在HEK293Ta細(xì)胞中PH1和PH2表達(dá)產(chǎn)生病毒顆粒所需的病毒蛋白并與穿梭質(zhì)粒組裝成有復(fù)制缺陷的慢病毒顆粒。將生長狀態(tài)良好的HEK 293Ta細(xì)胞傳至直徑為10 cm的雙碟中，所用培養(yǎng)基為含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)，換成含10%熱滅活FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A、PH1、PH2 3種質(zhì)粒按一定比例與Opti-MEM混合，EndoFectin-Lenti轉(zhuǎn)染試劑與Opti-MEM混合，靜置5 min后將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，逐滴加入細(xì)胞中，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，更換培養(yǎng)基為含5%熱滅活FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別于48 h和72 h收集含有病毒顆粒的細(xì)胞上清液。1000 r/m im離心1m in去除細(xì)胞碎片，取上清液于-80℃保存，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4慢病毒滴度測定

采用Real-time PCR法測病毒滴度。檢測前一天將HEK293Ta細(xì)胞傳至24孔板中，次日用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒液，取100μL稀釋好的病毒液加入細(xì)胞孔中于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃5min,42℃60 m in,70℃5m in。以cDNA為模板Real time PCR檢測EGFP基因表達(dá)情況，上游引物：TGCTTCAGCCGCTACCC，下游引物：AGTTCACCTTGATGCCGTTC。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 m in;95℃20 s,56℃20 s,72℃20 s,82℃5 s,共45個(gè)循環(huán)。溶解曲線65℃～95℃，每一步增加0.5℃，保持5 s。

1.2.5慢病度顆粒感染hUC-MSC及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

將生長狀態(tài)良好的hUC-MSC細(xì)胞傳至T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，將細(xì)胞液換成含5% FBS，1%雙抗，5μg/m L ploybrene的DMEM高糖培養(yǎng)基并加入收獲的病毒液，第2天換成含5%FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，4 d后加嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選9 d左右后提取細(xì)胞總蛋白及總RNA。

1.2.6 Real-time PCR檢測Mbd3轉(zhuǎn)錄情況

從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Mbd3 shRNA慢病毒的hUC-MSC細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板Real-time PCR檢測Mbd3表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參，所用引物序列如下：β-actin up:ACGTT GACATCCGTAAAGAC，β-actin down:GAAGGTACA GTGAGGC，Mbd3 up:TCAAGAGCGACCCGCAGA A，Mbd3 down:TGTCCCGTGATGGGCATG。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3m in;95℃20 s,56℃20 s,72℃20 s, 82℃5 s，共45個(gè)循環(huán)。溶解曲線65℃～95℃，每一步增加0.5℃，保持5 s。

1.2.7 Western blot檢測Mbd3蛋白表達(dá)情況

從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Mbd3 shRNA慢病毒的hUC-MSC細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白并用Lorrery法測定所提蛋白濃度，使各樣品蛋白濃度一致進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過電轉(zhuǎn)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液封閉2 h后孵育兔抗人Mbd3一抗（1∶1000稀釋），PBST洗滌PVDF膜后孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2000稀釋），PBST洗滌后膠片曝光觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的分離及培養(yǎng)

剪碎的臍帶組織塊貼壁后7 d左右可見貼壁生長的成纖維樣細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞呈克隆樣生長。普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核較大，細(xì)胞呈長梭形、短棒狀或扁平形，折光性好，核仁清晰可見，培養(yǎng)至10 d左右，細(xì)胞量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形，呈旋渦狀生長（圖1A）。原代細(xì)胞1∶2傳代后，細(xì)胞分布均勻，貼壁生長，細(xì)胞核較大，有的可清晰看到核仁，形態(tài)呈長梭形，平行生長或漩渦生長（圖1B）。3～4 d細(xì)胞密度達(dá)90%，可進(jìn)行傳代，體外至少可以傳代7次。

2.2 Mbd3 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

以重組慢病毒載體pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A和空慢病毒載體為模板進(jìn)行RCR并電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，結(jié)果顯示空載體可擴(kuò)增得到212 bp的DNA片段，pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A可得到260 bp的DNA片段（圖2）。測序結(jié)果也證明重組慢病毒載體pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A構(gòu)建成功。

2.3 Mbd3 shRNA重組慢病度的包裝及滴度測定

EndoFectin-Lenti轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pLVMbd3—shRNAEGFP-2A、PH1和PH2轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察，可見HEK293Ta表達(dá)綠色熒光（圖3A和3B)，說明pLVM bd3—shRNA-EGFP-2A成功轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞，并用收獲的病毒液感染HEK293Ta細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡觀察到綠色熒光，未被慢病毒感染的細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白（圖3C、D、E、F），說明成功包裝出具有感染活性的慢病毒顆粒。Real-timePCR檢測病毒滴度為2×106TU/m L（圖4）。

圖1 分離得到的原代hUC-MSCs(A)與傳代的hUC-MSCs(B)Fig 1 The cultureof primary hUC-MSCs(A) and sub-culturehUC-MSCs(B)

圖2 構(gòu)建的相關(guān)載體PCR鑒定結(jié)果Fig 2 The resultof PCR related vector1、2、3和4—以重組慢病毒載體pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A為模板；5—以慢病毒空載體為模板；M-DL500DNAMarker。

2.4 Mbd3 shRNA重組慢病度感染hUC-MSC及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

以2×104TU/m L的Mbd3 shRNA重組慢病度感染hUC-MSC細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后與熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，而對照組細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白（圖5），感染4 d后加入5μg/m L的嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選過程中可觀察到未被重組慢病度感染的hUCMSC細(xì)胞逐漸死亡，篩選9 d后可對細(xì)胞進(jìn)行傳代。

2.5 Real-time PCR檢測慢病毒感染的hUC-MSCs中Mbd3轉(zhuǎn)錄情況

提取4種Mbd3 shRNA重組慢病度（Mbd3 shRNA1、Mbd3 shRNA2、MbdshRNA control）感染的hUCMSC細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板在mRNA水平檢測Mbd3轉(zhuǎn)錄情況。與對照組相比較Mbd3 shRNA1、Mbd3 shRNA2和Mbd3 shRNA3對Mbd3的表達(dá)均有抑制效果，其中Mbd3 shRNA1和Mbd3 shRNA3的抑制效果更好（圖6）。

2.6 Western blot檢測慢病毒感染的hUC-MSCs中Mbd3蛋白表達(dá)情況

提取4種Mbd3 shRNA重組慢病度（Mbd3 shRNA1、Mbd3 shRNA2、MbdshRNA control）感染的hUC-MSC細(xì)胞總蛋白。Westernblot檢測結(jié)果表明：3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較Mbd3蛋白表達(dá)均有減少，其中Mbd3 shRNA1和Mbd3 shRNA3下調(diào)效果更好，Mbd3 shRNA3可以達(dá)到完全抑制的作用（圖7）。

圖4 Rea l-tim e PCR法測定慢病毒滴度Fig 4 The concentration determ ination of lentivirusby Real-time PCR

3 討論

圖5 慢病毒感染hUC-MSCs綠色熒光蛋白表達(dá)情況Fig 5 Theexpression of EGFPin hUC-MSCsafter infected by lentivirusA、B—重組慢病毒pLVMbd3 shRNA-EGFP-2A感染，hUC-MSCs綠色熒光蛋白表達(dá)情況；C、D—hUC-MSCs對照組綠色熒光蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞替代治療是指重建受損的組織結(jié)構(gòu)，恢復(fù)其正常功能從而達(dá)到治療疾病的目的。目前已經(jīng)證明多種疾病適用于細(xì)胞替代性治療，如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、視網(wǎng)膜變性疾病、青光眼等。但目前對用于細(xì)胞替代性治療的種子細(xì)胞的研究主要局限在胚胎干細(xì)胞，雖然不乏許多成功的案例，但由于這些細(xì)胞的獲取方式特殊和應(yīng)用時(shí)的不可預(yù)測性，使它不可避免的帶來一系列倫理問題，細(xì)胞來源受到很大的爭議，引起了衛(wèi)生系統(tǒng)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)、患者、研究者及投資者之間的利益沖突，使細(xì)胞替代治療廣泛應(yīng)用于臨床受到極大的限制。隨著2006年誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPSC）的發(fā)現(xiàn)，給細(xì)胞替代性治療的廣泛應(yīng)用帶來了曙光，也引起人們對iPSC的研究熱潮。

Mbd3作為NuRD的核心組成部分自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過大量研究證實(shí)，Mbd3的生化性質(zhì)并不像他名稱所描述的那樣有可與甲基化的CpG島鏈接結(jié)構(gòu)域，功能上也不像MBD家族蛋白一樣募集成NuRD后將DNA甲基化，包含Mbd3的NuRD復(fù)合物是通過序列特異性連接蛋白直接與靶基因結(jié)合定位染色質(zhì)修飾部位使組蛋白H3和H4氨基末端去乙?；?，從而沉默基因的轉(zhuǎn)錄［10］。為了確定Mbd3的功能，Kaji等［11］在缺乏細(xì)胞分化抑制因子LIF的條件下同時(shí)培養(yǎng)ES細(xì)胞和Mbd3缺陷的ES細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Mbd3缺陷的胚胎干細(xì)胞可以長期保持未分化狀態(tài)（長達(dá)30 d）并表達(dá)多能基因Oct4和Rex1，而野生型胚胎干細(xì)胞很快分化并下調(diào)了Oct4和Rex1的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mbd3缺陷的ES細(xì)胞破壞了胚胎的正常發(fā)育和形態(tài)發(fā)生，說明抑制Mbd3的表達(dá)可以限制干細(xì)胞的分化，提高細(xì)胞自我更新能力。近些年的大量研究也表明Mbd3調(diào)控基因的表達(dá)，抑制干細(xì)胞的分化，維持干細(xì)胞的多能性,促進(jìn)體細(xì)胞及多能干細(xì)胞向iPSC分化，重編程體細(xì)胞基因的表達(dá)［12-13］。Mbd3表達(dá)于發(fā)育每個(gè)階段的每一個(gè)細(xì)胞中,只在受孕后的頭3天不表達(dá)，而受精卵正是在這3天中開始分裂，可供給機(jī)體所需的所有細(xì)胞類型。從第4天開始分化啟動，并且細(xì)胞開始喪失它們的多能性，也就是在這時(shí)Mbd3蛋白才第一次出現(xiàn)，這一現(xiàn)象十分罕見，其對于產(chǎn)生醫(yī)用iPSCs具有重大的意義。

圖6 Rea l-tim e PCR檢測慢病毒重組質(zhì)粒對hUC-MSCs中MBD3基因表達(dá)的抑制效果Fig 6 The Real-time PCR analysis resultof Mbd3 in hUC-MSCD—重組慢病毒pLV Mbd3shRNA-EGFP-2A感染hUC-MSCs 9 d后Mbd3 mRNA水平。Huc1:1：pLV Mbd3shRNA 1-EGFP-2A；huc2：pLV Mbd3shRNA2-EGFP-2A；huc3：pLV Mbd3shRNA 3-EGFP-2A；huc control：pLV Mbd3shRNA control-EGFP-2A。

圖7 Western blot檢測慢病毒重組質(zhì)粒對hUC-MSCs中Mbd3蛋白表達(dá)情況Fig 7 TheWestern blotanalysisof Mbd3 in hUC-MSC1—pLVMbd3shRNA control-EGFP-2A；2—pLVMbd3shRNA 1-EGFP-2A；3—pLVMbd3shRNA2-EGFP-2A；4—pLVMbd3shRNA 3-EGFP-2A。

RNA干擾是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA)與細(xì)胞內(nèi)同源序列的mRNA特異性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解抑制相應(yīng)蛋白的表達(dá)。廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。RNAi技術(shù)具有高特異、高效率、可遺傳、操作簡單、可同時(shí)進(jìn)行多基因研究等優(yōu)點(diǎn)。目前常用的方法主要有脂質(zhì)體法、陽離子聚合物、電穿孔法、慢病毒介導(dǎo)發(fā)等。各種方法的干擾效率及作用時(shí)間長短各有不同，但因慢病毒具有感染效率高、感染細(xì)胞范圍廣，既能感染分裂活躍的細(xì)胞，又能感染非分裂或分裂緩慢的細(xì)胞、可將外源基因整合到宿主染色體上達(dá)到穩(wěn)定持久的表達(dá)效果、不在宿主細(xì)胞繁殖，不會引起宿主細(xì)胞死亡、攜帶外源基因較大等優(yōu)點(diǎn)，所以被作為體內(nèi)體外基因傳遞的有效工具［14-15］。

本實(shí)驗(yàn)首先成功構(gòu)建pLVMbdshRNA-EGFP(2A)重組慢病毒載體，并應(yīng)用HEK293Ta細(xì)胞包裝產(chǎn)生具有感染活性的慢病毒顆粒。因慢病毒載體攜帶有EGFP基因和Puromycin基因，所以可通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況確定慢病毒感染情況并粗略判斷其感染效率，通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。TR-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比pLVMbd3 shRNA1-EGFP(2A)和pLVMbd3 shRNA2-EGFP(2A)兩組Mbd3的mRNA水平均明顯下降。Western blot檢測結(jié) 果 也 表 明 pLVMbd3 shRNA1-EGFP(2A)和pLVMbd3shRNA3-EGFP(2A)兩組Mbd3蛋白的表達(dá)明顯下降，與RT-PCR結(jié)果一致。表明慢病毒介導(dǎo)的shRNA能高效穩(wěn)定沉默Mbd3的表達(dá)。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了pLVMbd3shRNAEGFP(2A)重組慢病毒載體，包裝產(chǎn)生了具有高感染活性的慢病毒顆粒，建立了穩(wěn)定下調(diào)Mbd3表達(dá)的hUCMSC細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究Mbd3對iPS產(chǎn)生的作用以及為將來成體干細(xì)胞直接跨胚層分化研究打下了前期基礎(chǔ)。

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Construction and appraisalof lentiviralshRNA vector silencehuman M bd3 gene expressing

YAN Shan-shan1,ZHOU Yan1,LIXi2,ZHANG Lei1,SUNMao-sheng1, XIEYu-ping1,LIHong-jun1

(1.Institute ofMedicalBiology,Chinese Academy ofMedicalSciences,Peking Union MedicalCollege, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research&Developmenton Severe InfectiousDisease,Kunm ing 650118；2.FirstA ffiliated Hospitalof Kunm ing MedicalUniversity,Kunm ing 650032,China）

In this study,we constructed a shRNA lentivirus particle,it is able to targetedly suppress Mbd3 expression and infecthuman umbilical cordmesenchymal stem cells(hUC-MSCs)lines screened by puromycin in which Mbd3 is down regulated stably.Specific siRNA was designed and dsDNA that could generate shRNA was synthesized based on the gene sequence of Mbd3.After double digestion,pLVshRNA-EGFP(2A)Puro vector was used to construct recombination lentivirus plasm id and transformed into E.coli DH5αsubsequently.The positive plasm id was screenedby PCR.Packaged lentivirus particle contained Mbd3 shRNA by HEK293Ta.Then hUC-MSCswere infected w ith this lentivirusand the effectof recombination lentiviruson theMbd3 gene silencewas detected through analysisofmRNA transcription level and protein level.The results showed that the lentivirus vectorwhich could interfere inMbd3 gene expression efficaciously was constructed and screened.Green fluorescence was observed through fluorescence microscope 48 h after hUC-MSCs were infected w ith this lentivirus and the expressions of Mbd3 gene and Mbd3 protein were significantly decreased through the detection by RT-PCR and Western blot 9 days after screening by puromycin.

Mbd3 gene;gene silencing;lentiviralvector;RNA interference

Q782;R556.5

A

2095－1736（2015）03－0015－06

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.015

2014-11-11；

2014-11-21

資助基金：云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品開發(fā)計(jì)劃（2012AE001)；協(xié)和青年基金和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（33320140082）

閆姍姍，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)研究；

李鴻鈞，研究員，長期從事干細(xì)胞及分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail：lihj6912@hotmail.com。